Análisis molecular de la interacción entre el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y sus hospedantes alternativos : plantas e insectos

Tesis presentada para optar al título de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en marzo de 2017

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país y es transmitido de manera persistente y propagativa por delfácidos. Diversas evidencias indican que los virus de este género se originaron de un virus de insectos ancestral y más recientemente adquirieron la capacidad de infectar plantas. La replicación viral está limitada al floema de gramíneas donde provoca síntomas severos, mientras que ocurre en diversos tejidos y es asintomática en los delfácidos vectores. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA) que codifican para trece proteínas. El actual manejo de la enfermedad se realiza a través del monitoreo y control del principal insecto vector, D. kuscheli. Sin embargo, no se han desarrollado prácticas adecuadas ni existen cultivares resistentes en el caso de un eventual brote. El desarrollo de nuevas tecnologías de bajo impacto ambiental que permitan controlar efectivamente la virosis depende de la generación de conocimiento básico sobre la interacción hospedante-virus, particularmente sobre el ciclo viral y de los mecanismos de defensa de ambos hospedantes. El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo de regulación génica específico de secuencia que a su vez funciona como sistema de defensa antiviral. Con el objetivo de caracterizar la respuesta diferencial en plantas e insectos infectados con MRCV, se realizó un ensayo de infección controlada utilizando el insecto vector D. kuscheli y plántulas de trigo como modelo hospedante. Se secuenciaron los RNAs pequeños de ambos hospedantes y se caracterizó el perfil de aquellos derivados del genoma viral (vsiRNAs). Se determinó que, mientras que la respuesta en plantas se caracteriza por la generación de “puntos calientes” muy marcados de vsiRNAs enprácticamente todos los segmentos, en insectos la acumulación resultó más homogéneamente distribuida. Por otro lado, la proporción de vsiRNAs derivados de ambas hebras fue prácticamente la misma en ambos hospedantes, por lo que se presume que la maquinaria de silenciamiento tiene acceso a todo el largo de los segmentos en algún momento del ciclo infectivo. Adicionalmente, en plantas se observó una acumulación preferencial de vsiRNAs en el primer tercio de gran parte de los segmentos genómicos, y una correlación inversa entre la acumulación de vsiRNAs y el largo de los segmentos. En D. kuscheli, se identificaron piRNAs por primera vez en esta especie y se descartó la participación directa de los mismos en el silenciamiento antiviral. Finalmente, el análisis del perfil mutacional del virus dentro de cada hospedante evidenció la presencia de sitios altamente variables que son únicos para cada hospedante y que dan lugar mayoritariamente a mutaciones no sinónimas que probablemente se deban a un proceso adaptativo. Dentro de los mecanismos desencadenados por los virus durante el establecimiento de la infección se encuentra la modulación de la expresión de genes del hospedante. Esto puede conducir a cambios en la expresión de genes potencialmente involucrados en la producción de síntomas y/o que intervienen en mecanismos de defensa como el silenciamiento génico que restringen la replicación viral. Con el objetivo de identificar alteraciones en la acumulación de RNAs mensajeros ante la infección con MRCV, se realizó un RNAseq en plantas de trigo infectadas a dos etapas tempranas: 12 y 21 días post infección. Se realizó la anotación manual del genoma de trigo recientemente liberado (TGACv1) y se determinaron los genes diferencialmente expresados a cada tiempo utilizando dos métodos estadísticos. Estudios de enriquecimiento funcional revelaron que la infección con MRCV induce la sobreexpresión de genes que intervienen en la traducción, la biosíntesis de celulosa y la modificación de ácidos nucleicos. Dentro de las categorías de genes subexpresados se encuentran algunos relacionados con vías hormonales implicadas en el desarrollo y crecimiento de la planta: auxinas, citoquininas y brasinoesteorides. El MRCV y la mayor parte de los fijivirus poseen tres segmentos bicistrónicos S5, S7 y S9, y se desconoce el mecanismo implicado en la traducción de los ORFs ubicados hacia el extremo 3’. El segmento S5 presenta un marco abierto de lectura (ORF5-2) parcialmente superpuesto al primero (P5-1). Estudios de genómica comparativa de secuencias del S5 de varias especies de fijivirus permitieron la identificación de una secuencia “UCU_UUU_CG” altamente conservada que podría funcionar como un sitio de deslizamiento ribosomal en la región superpuesta hacia el extremo 5' del ORF 5-2. En este trabajo de Tesis, se llevaron adelante experimentos de traducción in vitro del segmento S5 utilizando diferentes construcciones mutantes que comprobaron experimentalmente la existencia del frameshift que da lugar a una proteína de fusión P5-1/2. Si bien aún resta ahondar en los mecanismos moleculares que ulteriormente determinan la sintomatología, los resultados contenidos en esta Tesis constituyen un insumo sumamente valioso para continuar avanzando en la comprensión del patosistema y poder eventualmente dar lugar a productos biotecnológicos que formen parte de un diseño racional, integrado y sustentable de estrategias de control de la enfermedad.

Mal de Río Cuarto Virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize disease in Argentina and it is transmitted in a persistent and propagative manner by delphacids. Evidence indicates that viruses of this genus evolved from an ancestral insect virus that more recently acquired the ability to infect plants. Viral replication is limited to phloem tissue of grasses causing severe symptoms, whereas in insect vectors occurs in multiple tissues and is asymptomatic. MRCV genome consists of ten double-stranded RNA segments (dsRNA) coding for thirteen proteins. At present, there are no effective management strategies for controlling the disease. Development of new technologies with low environmental impact for virus control depends on basic knowledge about host-virus interaction, particularly on the replication cycle and the defense mechanisms of both hosts. Post-transcriptional gene silencing is an antiviral defense mechanism widely spread among eukaryotes. In order to describe the silencing responses of plant and insects infected with MRCV and to characterize possible distinct features of both responses, a controlled infection experimentwas performed using the insect D. kuscheli as a vector and wheat seedlings as a plant host model. Small RNAs from both hosts were sequenced and virus-derived siRNAs (vsiRNAs) profiles were characterized. We found that, while the response in plants showed conspicuous "hot spots" of vsiRNAs in nearly all genome segments, in insects vsiRNAs accumulation was homogeneously distributed. Furthermore, the proportion of vsiRNAs derived from + and - strands was practically the same in both hosts, indicating that the silencing machinery has access to full length segments at some point of the infective cycle. In addition, in plants, preferential accumulation of vsiRNAs within the upstream 30% region of most of the virus segments and an inverse correlation between the accumulation of vsiRNAs and the length of the segments were observed. In D. kuscheli, the piRNA pathway was shown to be active for the first time but not involved in the production of virus derived piRNAs. Finally, the analysis of the virus mutational landscape evidenced the presence of a large number of distinct variable positions within each host, most of them causing non synonymous mutations and possibly reflecting an adaptive process. Virus infection induces changes in the modulation of host gene expression that could be potentially responsible of symptom development. In order to identify alterations in the mRNA profile upon early stages of MRCV infection, controlled wheat infections followed by RNAseq were performed at 12 and 21 dpi. Annotation of the new release of wheat genome (TGACv1) was done and differentially expressed genes were identified using two statistical methods. Functional enrichment analysis revealed that MRCV infection induces overexpression of genes involved in translation, cellulose biosynthesis and nucleic acid modifications. In turn, subexpressed genes were enriched in categories related to perception and biosynthesis of diverse phytohormones (cytokinins, brasinoesteroids and auxins), all of them involved in plant development. S5, S7 and S9 MRCV segments are bicistronic and the mechanisms involved in the translation of 3’ ORFs have not yet been determined. Segment S5 has two partially overlapping open reading frames (ORF5-1 and ORF5-2). The use of comparative genomics analysis has allowed the identification of a highly conserved sequence "UCU_UUU_CG" that could function as a slippery site for +1 ribosomal frameshifting rendering a P5-1/2 trans frame fusion protein. In this PhD work, in vitro translation experiments of different mutant constructs of S5 segment allowed to experimentally verify the existence of a +1 frameshift that gives rise to a fusion P5-1/2 protein. Although further research on the molecular mechanisms involved in plants symptom-development upon MRCV infection is needed, the results obtained during this Thesis constitute an extremely valuable input for the understanding of the patosystem, and eventually may give rise to knowledge-based biotechnological products that contribute to rational, integrated and sustainable strategies for disease control.

Instituto de Biotecnología

Fil: De Haro, Luis Alejandro. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: De Haro, Luis Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: De Haro, Luis Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina