Gene expression and proteomics of sexually selected traits in red deer: antler development and dark ventral patch signaling | Expresión génica y proteómica de los caracteres sexuales en el ciervo: desarrollo de las cuernas y señalización de la mancha oscura ventral

Sexual selection is a fundamental evolutionary force shaping the development of morphological, physiological, behavioral and sex-specific traits that enhance reproductive success. These traits, such as ornaments and weapons, are crucial in intrasexual competition and mate choice and are regulated by complex network of gene expression, hormonal activity and molecular mechanisms. In red deer (Cervus elaphus), two prominent sexually selected features, the antlers and the dark ventral patch (DVP), are influenced by both intrinsic factors and social environmental conditions. These traits are dynamic, environmentally sensitive, and play a pivotal role in male-male competition during the rutting season. This doctoral thesis explores the molecular underpinnings of these traits through a combination of gene expression analysis and proteomic profiling, aiming to uncover how sexual competition for mates modulates sexual trait expression in red deer males at the genetic and biochemical levels. The thesis is organized into three chapters, each addressing specific objectives. Chapter I focuses on the evaluation of candidate reference genes for accurate normalization in quantitative real-time PCR (qRT-PCR) studies using antler blood. A panel of eight commonly used housekeeping genes was assessed for expression stability, with B2M, ACTB, and RPLP0 identified as the most stable reference genes. These genes were then used to normalize the expression of target genes associated with antler development, ANXA2, APOD, and TPM1, revealing age-dependent differences in expression between young and adult males. This work establishes a validated framework for future gene expression studies in antler tissue and blood, critical for understanding the regenerative biology of antlers. Chapter II explores the influence of the social environment, specifically the level of intrasexual competition, on the expression of genes involved in catecholamine biosynthesis, particularly dopamine β-hydroxylase (DBH) and tyrosine hydroxylase (TH), which are central to norepinephrine production. The DVP, a visual and chemical sexual signal, exhibits plasticity based on population structure and competitive pressure. Adrenal gland samples from males in highcompetition (fenced) and low-competition (open) populations were analyzed. The results show significant upregulation of DBH and TH in individuals from highcompetition environments, suggesting a plastic molecular response to social context. Additionally, dopamine levels were found to be lower in high-competition males. Alternative splicing in TH was observed but not differentially regulated across environments. These findings support the hypothesis that gene expression of sexual traits in red deer is not static, but rather plastically modulated by environmental and social stimuli, with DBH emerging as a candidate biomarker for reproductive investment. Chapter III provides a comprehensive proteomic analysis of the DVP, a bimodal sexual signal with both visual and olfactory components. By means of mass spectrometry, proteins extracted from DVP hair samples were identified, revealing differential protein profiles between sexes and between social competition contexts. Using a shotgun proteomic approach, several different proteins associated with chemical communication, stress response, and immune function were found, indicating their potential role in sexual signaling. Notably, the presence of specific proteins in the DVP hair may convey information about an individual’s condition, status, or reproductive capacity, thus influencing mate choice and malemale interactions. Taken together, this research demonstrates that gene expression and protein composition of sexually selected traits in red deer, both antler and DVP, are highly plastic and responsive to social environmental pressures. By integrating gene expression and proteomic approaches in a wild non-model species, this thesis contributes valuable insights into the molecular mechanisms underlying sexual trait development, phenotypic plasticity, and sexual selection. Moreover, the findings have broader implications for evolutionary biology, wildlife management, and conservation strategies, especially in the context of anthropogenic pressures and changing population dynamics.

La selección sexual es una fuerza evolutiva fundamental que da forma al desarrollo de caracteres morfológicos, fisiológicos, del comportamiento y específicos del sexo que incrementan el éxito reproductivo. Estos rasgos, como los ornamentos y las cuernas, son cruciales en la competencia intrasexual, y en la elección de pareja, y están regulados por complejas redes de expresión génica, actividad hormonal y mecanismos moleculares. En el ciervo (Cervus elaphus), dos características prominentes seleccionadas sexualmente, las cuernas y la mancha oscura ventral (del inglés, Dark Ventral Patch, DVP), están influenciadas tanto por factores intrínsecos como por condiciones del entorno social. Estos rasgos son dinámicos, sensibles al ambiente y desempeñan un papel fundamental en la competencia entre machos durante la época de celo. Esta tesis doctoral explora las bases moleculares de estos caracteres mediante una combinación de análisis de expresión génica y perfil proteómico, con el objetivo de comprender cómo la competencia sexual por el apareamiento modula la expresión de los caracteres sexuales en machos de ciervo a nivel genético y bioquímico. La tesis se organiza en tres capítulos, cada uno abordando objetivos específicos. El Capítulo I se centra en la evaluación de genes de referencia candidatos para una normalización precisa en estudios de PCR en tiempo real (qRT-PCR) utilizando sangre de cuernas. Se evaluó la estabilidad de expresión de un panel de ocho genes constitutivos comúnmente utilizados, identificándose B2M, ACTB y RPLP0 como los genes de referencia más estables. Estos genes se utilizaron posteriormente para normalizar la expresión de genes diana asociados al desarrollo de las cuernas (ANXA2, APOD y TPM1), revelando diferencias en la expresión dependientes de la edad entre machos jóvenes y adultos. Este trabajo establece un marco validado para futuros estudios de expresión génica en tejido y sangre de cuernas, crucial para entender la biología regenerativa de las mismas. El Capítulo II explora la influencia del entorno social, en particular el nivel de competencia intrasexual, sobre la expresión de genes implicados en la biosíntesis de catecolaminas, especialmente la dopamina β-hidroxilasa (DBH) y la tirosina hidroxilasa (TH), que son esenciales en la producción de noradrenalina. La DVP, una señal sexual visual y química, muestra plasticidad en función de la estructura poblacional y la presión competitiva. Se analizaron muestras de glándulas suprarrenales de machos procedentes de poblaciones con alta competencia (fincas cercadas) y baja competencia (fincas abiertas). Los resultados muestran un incremento significativo de DBH y TH en individuos de ambientes de alta competencia, lo que sugiere una respuesta molecular plástica al contexto social. Además, se observaron niveles más bajos de dopamina en los machos de alta competencia. Se detectó “splicing” alternativo en el gen TH, aunque no fue diferencial entre ambientes sociales. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la expresión génica de los caracteres sexuales en el ciervo no es estática, sino que está modulada de forma plástica por estímulos sociales y ambientales, emergiendo DBH como un biomarcador potencial de inversión reproductiva. El Capítulo III presenta un análisis proteómico exhaustivo de la DVP, una señal sexual bimodal con componentes tanto visuales como olfativos. Mediante espectrometría de masas, se identificaron proteínas extraídas de muestras de pelo de la DVP, revelando perfiles proteicos diferenciales entre sexos y entre contextos de competencia social. Utilizando un enfoque proteómico tipo shotgun, se identificaron varias proteínas relacionadas con la comunicación química, la respuesta al estrés y la función inmune, lo que indica su posible papel en la señalización sexual. Es especialmente relevante la presencia de proteínas específicas en el pelo de la DVP, ya que podrían transmitir información sobre la condición, el estatus o la capacidad reproductiva del individuo, influyendo así en la elección de pareja y en las interacciones entre machos. En conjunto, esta investigación demuestra que la expresión génica y la composición proteica de los caracteres seleccionados sexualmente en el ciervo, tanto las cuernas como la DVP, son altamente plásticos y responden a las presiones del entorno social. Al integrar enfoques de expresión génica y análisis proteómico en una especie silvestre no modelo, esta tesis aporta conocimientos valiosos sobre los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo de rasgos sexuales, la plasticidad fenotípica y la selección sexual. Además, los resultados tienen implicaciones más amplias en biología evolutiva, gestión de fauna silvestre y estrategias de conservación, especialmente en el contexto de las presiones antropogénicas y las dinámicas poblacionales cambiantes