PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PAPAIN INHIBITORS FROM AMARANTO (Amaranthus caudatus) AND FRIJOL (Phaseolus vulgaris) SEEDS | PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE INHIBIDORES DE PAPAÍNA PROVENIENTES DE SEMILLAS DE AMARANTO (Amaranthus caudatus) Y FRIJOL (Phaseolus vulgaris)

إنجليزي. Plant protease inhibitors are often low molar mass proteins and are present in plant storage and aerial tissues. Their expression is induced in response to damage by insects and pathogenic microorganisms, and the content of these inhibitors can be high in cereal and legume organs. Under the premise that the combination of low and high resolution protein purification techniques allows increasing the specific activity of protease inhibitors present in plant tissues, the objective of this study was to isolate, purify, and biochemically characterize papain inhibitors from amaranth (Amaranthus caudatus) and bean (Phaseolus vulgaris) seeds. Completely randomized experimental designs were used to select low resolution techniques that significantly increase (p≤0.05) the purification degree of the treated extracts. In all studies, three replicates were made, and measurements were performed in triplicate. Crude protein extracts were obtained from amaranth and bean seed flours, which were then ultrafiltered in 10 kDa membranes. Low molar mass fractions were purified by affinity chromatography in papain-glyoxyl-sepharose 6B-CL. The crude amaranth extract presented inhibitory activity of 1.177 ± 0.067 mU·mL-1, and the bean extract presented an inhibitory activity of 1.556 ± 00.542 mU·mL-1. The amaranth and bean extracts with partial purification were purified by affinity chromatography in papain-glioxyl-sepharose 6B-CL, up to 137.5 and 79.1 times, respectively. The estimated molar mass was 7.50 kDa for the amaranth inhibitor, and 8.20 kDa for the bean inhibitor. The amaranth inhibitor showed competitive inhibition with 0.872 µM Ki, while the bean inhibitor was non-competitive with 0.058 µM Ki. This demonstrates the presence of cysteine protease inhibitors in amaranth and bean seeds.

الأسبانية؛ قشتالية. Los inhibidores de proteasas vegetales con frecuencia son proteínas de baja masa molar, presentes en tejidos de almacenamiento y aéreos de las plantas. Su expresión se induce en respuesta al daño por insectos y microorganismos patógenos y el contenido de estos inhibidores puede ser alto en órganos de cereales y leguminosas. Bajo la premisa de que la combinación de técnicas de purificación de proteínas de baja y alta resolución permite incrementar la actividad específica de inhibidores de proteasas presentes en tejidos vegetales, el objetivo de este estudio fue aislar, purificar y caracterizar bioquímicamente inhibidores de papaína a partir de semillas de amaranto (Amaranthus caudatus) y frijol (Phaseolus vulgaris). El diseño experimental fue completamente al azar para seleccionar las técnicas de baja resolución que incrementan significativamente (p≤0.05) el grado de purificación de los extractos tratados. En todos los estudios se hicieron tres repeticiones y las mediciones se realizaron por triplicado. A partir de harinas de semillas de amaranto y frijol se obtuvieron extractos proteicos crudos que después se ultrafiltraron en membranas de 10 kDa. Las fracciones de baja masa molar se purificaron por cromatografía de afinidad en papaína-glioxil-sepharosa 6B-CL. El extracto crudo de amaranto presentó actividad inhibidora de 1.177 ± 0.067 mU·mL-1 y el de frijol 1.556 ± 0.542 mU·mL-1. Los extractos con purificación parcial de amaranto y frijol se purificaron por cromatografía de afinidad en papaína-glioxil-sepharosa 6B-CL, hasta 137.5 y 79.1 veces, respectivamente. La masa molar estimada fue 7.50 kDa para el inhibidor de amaranto y 8.20 kDa para el de frijol. El inhibidor de amaranto mostró inhibición competitiva con Ki de 0.872 µM, mientras que la del frijol fue no competitiva y con Ki de 0.058 µM. Esto evidencia la presencia de inhibidores de cisteíno proteasas en las semillas de amaranto y frijol.