Byrsonima intermedia A Juss: in vitro culture and cryopreservation of seeds and shoots

Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia/Fisiologia Vegetal, área de concentração em Fisiologia Vegetal, para a obtenção do título de "Doutor".

The Brazilian Cerrado, the second largest biome in South America with the one of the biggest plant biodiversity on the planet, is an endangered ecosystem that may disappear into 2030. In vitro propagation is an efficient technique to produce a large amount of contaminants free plant material and may be used for multiplication of native plant species that are difficult to propagate. The conservation of biological material at ultra-low temperatures (-196°C) in liquid nitrogen is known as cryopreservation. Cryopreservation allows indefinite long-term storage preserving all explant characteristics. It is a promising technique for the preservation of plant diversity. Byrsonima intermedia A. Juss. is a plant from the Cerrado that has medicinal properties. The aim of this study was to develop an efficient micropropagation protocol and to cryopreserve zygotic embryos through rapid freezing and shoot apical meristems using droplet vitrification. Seeds of Byrsonima intermedia were decontaminated and desiccated in a laminar airflow bench until four hours prior plunge in liquid nitrogen. The influence of BAP, GA3 and activated charcoal on in vitro shoot multiplication was investigated. For shoot elongation, the combination of GA3 and darkness were tested. The action of rooting substances like: IBA, phloroglucinol, 1-aminocyclopropane-1-carboxilic, silver thiosulfate, and a commercial rooting powder were also evaluated. Apical shoot-tips were subjected to dehydration for different length of PVS2 treatment (0-45 min) at 0°C prior to cooling. Moreover, the influence of the shoot-tips pre- and pos-culture on MS with 0.3 M sucrose and the shoots pre-growth on medium with high sucrose or sorbitol concentrations prior shoot-tips pre-culture were tested. Desiccated embryos with moisture content between 20.3% and 34.3% successfully germinated after cryopreservation. Non desiccated embryos did not survive the freezing. MS medium supplemented with 4 µM of BAP and GA3 presented the highest shoot multiplication. Shoots elongation was carried out on MS with 10 µM GA3 combined with darkness during the first and third weeks of culture. Rhizogenesis was successfully achieved using the rooting powder Rootone® and rooted shoots were acclimated after 60 days of rooting treatment. A culture medium for shoot-tips growth was established using WPM with 2.22 µM BAP. Shoot-tips were successfully cryopreserved through droplet vitrification after 24 h of pre-culture on MS with 0.3 M sucrose prior dehydration on PVS2 at 0°C for 30 min. The use of sorbitol increased the survival of non pre-cultured shoot-tips after cryopreservation. Up to 90% of pre-cultured shoot-tips presented regrowth after thawing. To conclude; (i) zygotic embryos can be successfully cryopreserved after one hour of desiccation, (ii) an efficient micropropagation protocol was developed and (iii) Byrsonima intermedia shoot apical meristems can be successfully cryopreserved through droplet vitrification.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Fisiologia Vegetal

O Cerrado brasileiro é o segundo maior bioma da América do Sul com uma das maiores biodiversidade de plantas do planeta, é um ecossistema ameaçado que pode desaparecer em 2030. O cultivo in vitro é uma eficiente técnica utilizada para produção de grande quantidade de material vegetal livre de contaminantes e pode ser utilizado para a multiplicação de espécies nativas com dificuldades de propagação. A conservação de material biológico em temperatura ultra-baixa (-196°C) em nitrogênio líquido é conhecido como criopreservação. Criopreservação permite o armazenamento em longo prazo mantendo todas as características dos explantes indefinidamente. A criopreservação é uma técnica promissora para a preservação da diversidade de plantas. Byrsonima intermedia A. Juss., é uma espécie do Cerrado que apresenta propriedades medicinais. O objetivo deste estudo foi desenvolver um eficiente protocolo de micropropagação e criopreservação de embriões zigóticos através de congelamento rápido e criopreservar meristemas apicais de parte aérea utilizando droplet vitrification. Sementes de B. intermedia foram desinfestadas e dessecadas em fluxo laminar por quatro horas antes da imersão em nitrogênio líquido. A influência do BAP, GA3 e carvão ativado foram investigados para a multiplicação de brotações in vitro. Para alongamento, a combinação de GA3 e ausência de luz foram testadas. A ação de substâncias promotoras de enraizamento como: IBA, floroglucinol, 1-aminociclopropano-1-carboxílico, tiossulfato de prata, e um pó comercial de enraizamento também foram avaliados. Meristemas apicais foram submetidos à desidratação por diferentes períodos de tratamento (0-45 min) em PVS2 a 0°C antes de congelamento. A influência do pré- e pós-cultivo dos meristemas em meio MS com 0,3 M de sacarose e pré-crescimento de brotações em meio com alta ou concentração de sacarose ou sorbitol, antes do pré-cultivo dos meristemas, também foram testadas. Embriões dessecados com teor de umidade entre 20,3% e 34,3% germinaram com sucesso após a criopreservação. Os embriões não dessecados não sobreviveram ao congelamento. Meio MS com 4.0 µM de BAP e GA3 apresentou o melhor resultado para a multiplicação das brotações. O alongamento das brotações foi realizado em MS com 10 uM GA3 combinado com ausência de luz na primeira e terceira semanas de culivo. A rizogênese foi obtida com sucesso usando o pó comercial de enraizamento (Rotone®) e os brotos enraizados foram aclimatizados após 60 dias do tratamento de enraizamento. O meio de cultivo para o crescimento dos meristemas foi estabelecido utilizando WPM com 2,22 µM BAP. Meristemas apicais foram criopreservados com sucesso através da droplet vitrification após 24 h de pré-cultivo em MS com 0,3 M de sacarose antes da desidratação em PVS2 a 0°C durante 30 min. A utilização de sorbitol aumentou a sobrevivência dos meristemas não pré-cultivados após a criopreservados. Mais de 90% dos meristemas pré-cultivados apresentaram crescimento após o descongelamento. Em conclusão, (i) embriões zigóticos podem ser criopreservados com sucesso após uma hora de dessecação, (ii) um eficiente protocolo de micropropagação foi desenvolvido e (iii) os meristemas apicais de Byrsonima intermedia podem ser criopreservados com sucesso através da técnica de droplet vitrification.