Avances en el conocimiento de la sarcocistiosis de camélidos sudamericanos y desarrollo de herramientas para su control

Tesis para optar al título de Doctora en Farmacia y Bioquímica - Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2018

Los camélidos sudamericanos (CS) llama y alpaca, domesticados en tiempos prehispánicos, constituyen aún el principal ganado de las comunidades andinas. El guanaco y vicuña por su parte son CS silvestres que en general se explotan en silvestría. La fibra es el recurso más explotado de los CS. Además, la carne de llamas y alpacas es la principal fuente proteica de las comunidades rurales andinas y, junto con la carne de guanaco, constituye un producto atractivo para mercados nacionales e internacionales por su bajo impacto ambiental, alto valor nutritivo y bajo contenido de colesterol. El mayor problema en la comercialización de carne de CS es la infección por el protozoo Sarcocystis aucheniae que produce quistes macroscópicos en la musculatura. La carne infestada con quistes es decomisada o depreciada y si se consume insuficientemente cocida produce gastroenteritis. Los quistes solo pueden detectarse por inspección visual al momento de la faena y no existen vacunas o drogas, para prevenir o tratar las infecciones. Por estos motivos, esta Tesis se ha enfocado en aumentar el conocimiento de la sarcocistiosis de CS y en la búsqueda de herramientas para su control. Se desarrolló una PCR semi-anidada que detecta ADN de S. aucheniae con alta especificidad y sensibilidad. Con ella se pudo constatar por primera vez la presencia del parásito en la sangre de llamas, alpacas, guanacos y vicuñas. En un total de 225 muestras de sangre de llama recolectadas en Argentina y Bolivia, el 18,7% resultaron positivas para S. aucheniae. No se encontró correlación entre detección molecular y edad, sexo o ubicación geográfica de los animales. Tampoco hubo correlación entre la presencia de quistes y la detección molecular, por lo que puede concluirse que esta PCR semi anidada no es útil como método diagnóstico previo a la faena, aunque puede ser aplicada para estudiar focos de infección o evaluar la efectividad de tratamientos parasiticidas. Con este método, además, se detectó ADN de S. aucheniae en materia fecal de perros de Jujuy, apoyando la hipótesis que el perro es un hospedador definitivo del parásito. También se identificaron una serie de fracciones proteicas solubles en macroquistes de S. aucheniae que fueron reconocidas mayoritariamente por inmunoglobulinas IgG de llamas infestadas, lo cual las señala como candidatos para diagnóstico serológico que serán explorados a futuro. Asimismo, se hallaron evidencias de la transferencia pasiva de inmunoglobulinas IgG contra S. aucheniae a la cría. Finalmente, se secuenció y analizó el transcriptoma de bradizoítos de S. aucheniae para predecir: (i) el camino metabólico del glicosilfosfatidilinositol (GPI), (ii) el proteoma anclado por GPI y (iii) la toxina “sarcocistina”. Los GPIs tienen gran importancia en la biología de protozoos patógenos, y su síntesis es un potencial blanco terapéutico. Aquí, se identificaron 22 enzimas que participarían en la síntesis de una molécula de GPI compuesta por N-acetilglucosamina y tres manosas, y su transferencia a una proteína naciente. Por otra parte, las proteínas ancladas por GPI han sido caracterizadas en otros protozoos como altamente inmunogénicas y fueron empleadas como antígenos para diagnóstico serológico y vacunas. Se identificaron 25 proteínas ancladas por GPI, 6 de las cuales son especie-específicas y 13 son homólogas de las proteínas SAG de otros coccidios. Adicionalmente, se halló la proteína homóloga a la sarcocistina de S. fayeri, que posiblemente sea responsable de los cuadros de gastroenteritis mencionados. La presente Tesis aporta información original y relevante sobre S. aucheniae, un parásito prácticamente olvidado por la comunidad científica, así como herramientas para su control, que pueden tener importantes implicancias para la explotación sustentable de CS y el fortalecimiento de las economías que dependen de este recurso.

The South American camelids (CS) llama and alpaca, domesticated in prehispanic times, are to this day the main cattle of Andean communities. Guanaco and vicugna, in turn, are wild CS and generally exploited as free living animals. Fiber is the main resource extracted from CS. In addition, meat from llamas and alpacas is the principal protein source of Andean rural communities, and together with guanaco meat, constitutes an attractive product for local and international markets due to its low environmental impact, high nutritional value and low cholesterol contents. A major problem in the commercialization of CS meat is the infection by the protozoon Sarcocystis aucheniae that produces macroscopic cysts in muscles. Meat infested with cysts is confiscated or depreciated, and if insufficiently cooked its consummation produces gastroenteritis. Cysts can only be detected by visual inspection upon slaughter and there are no vaccines or drugs to prevent or treat the infection. On this account, the Thesis at hand has focused in increasing the knowledge of CS sarcocystosis and searching for control tools. A semi-nested PCR was developed that detects S. aucheniae DNA with high specificity and sensitivity. This assay allowed to demonstrate for the first time the presence of parasites in blood of llamas, alpacas, guanacos, and vicugnas. In a total of 225 samples of llama blood collected in Argentina and Bolivia, 18.7% tested positive for S. aucheniae. No correlation was found between molecular detection and age, gender or geographic location of the studied animals. Neither, a correlation was found between the presence of cysts and molecular detection and thus, it can be concluded that this semi-nested PCR is not useful as a pre-slaughter diagnostic method, although it could be applied to study infection foci or evaluate the effects of parasiticide treatments. In addition, this method was used to detect S. aucheniae DNA in feces of dogs from the province of Jujuy, supporting the hypothesis that the dog is a definitive host of the parasite. We identified a series of soluble protein fractions in S. aucheniae macrocysts that were recognized by most sera of llamas infested with cysts, which highlights their potential as serological diagnostic candidates that will be characterized in the future. Additionally, evidence of passive transfer of IgG immunoglobulins against S. aucheniae to llama offspring was obtained. Finally, the transcriptome of S. aucheniae bradyzoites was sequenced and analyzed to predict: (i) the biosynthetic pathway of glycosylphosphatidylinositol (GPI); (ii) the GPI-anchored proteome, and (iii) the “sarcocystin” toxin. GPIs have great importance in the biology of pathogenic protozoa and their synthesis is a potential therapeutic target. Here, we identified 22 enzymes that might participate in the synthesis of a GPI molecule composed of N-acetylglucosamine and three mannoses, as well as its transfer to a nascent protein. GPI-anchored proteins have been characterized in other protozoa as highly immunoreactive and have been used as antigens for serological diagnosis and vaccines. Twenty-five S. aucheniae proteins were identified as GPI-anchored, 6 of which are species-specific and 13 are homologues of “SAG” proteins of other coccidian. Additionally, we identified the S. aucheniae protein homologous to S. fayeri sarcocystin responsible for the above mentioned symptoms of gastroenteritis. This Thesis contributes original and relevant information on S. aucheniae, a parasite neglected by the scientific community, as well as tools for its control, that might significantly contribute to the sustainable exploitation of CS and the strengthening of the economies that depend on this resource.

Instituto de Patobiología

Fil: Decker Franco, Cecilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

Fil: Decker Franco, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiologia; Argentina

Fil: Decker Franco, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina