Desarrollo de un método sencillo y rápido para el recuento de C. elegans mediante espectrofotometría y/o análisis de imágenes | Use of the spectrophotometry and/or image analysis technique as an easy and fast tool for counting C. elegans | Desenvolupament d'un mètode senzill i ràpid per al recompte de C. elegans mitjançant espectrofotometria i/o anàlisi d'imatges

[ES] La cuantificación precisa de Caenorhabditis elegans es esencial en múltiples ámbitos de investigación, desde estudios de toxicidad hasta ensayos de desarrollo o envejecimiento. Tradicionalmente, esta tarea se ha realizado mediante recuento manual, un proceso laborioso y propenso a errores. En este trabajo se evaluaron dos metodologías indirectas (el análisis de imágenes microscópicas y la espectrofotometría) con el objetivo de establecer alternativas más rápidas reproducibles y accesibles al recuento manual. Para ello, se analizaron muestras de nemátodos enteros y deshechos, teñidas y sin teñir, aplicando modelos matemáticos multivariante (PCA y PLS) que permitieron relacionar parámetros ópticos con el número de individuos. Los resultados mostraron que no todas las condiciones son igualmente válidas. El análisis de imágenes sin tinción y la espectrofotometría con nemátodos enteros sin teñir ofrecieron baja capacidad predictiva y elevada dispersión, por lo que no pueden considerarse técnicas adecuadas. En cambio, la tinción con rosa de bengala mejoró de forma significativa el rendimiento de ambas metodologías, al inmovilizar los individuos y aportar una señal característica en torno a 550 nm. Asimismo, la lisis de las muestras redujo el solapamiento entre individuos, mejorando la linealidad de la respuesta. La combinación de ambas estrategias (tinción y lisis) aplicada a la espectrofotometría resultó ser la condición óptima, alcanzando un poder predictivo muy elevado (R2=0,97) y constituyendo la alternativa más robusta y fiable frente al conteo manual. Este trabajo demuestra que, aunque el análisis de imágenes puede ser útil como aproximación preliminar, es la espectrofotometría en muestras deshechas y teñidas la que ofrece la mayor precisión, reproducibilidad y escalabilidad. Estos hallazgos asientan las bases para el desarrollo de métodos automatizados de cuantificación de Caenorhabditis elegans, capaces de sustituir al recuento manual en entornos experimentales de alta demanda.

[EN] The precise quantification of Caenorhabditis elegans is essential in multiple research fields, ranging from toxicity studies to developmental or aging assays. Traditionally, this task has been carried out through manual counting, a laborious and error-prone process. In this work, two indirect methodologies (microscopic image analysis and spectrophotometry) were evaluated with the aim of establishing faster, reproducible, and more accessible alternatives to manual counting. To this end, samples of whole and lysed nematodes, both stained and unstained, were analyzed by applying multivariate mathematical models (PCA and PLS) that allowed optical parameters to be related to the number of individuals. The results showed that not all conditions are equally valid. Image analysis without staining and spectrophotometry with whole unstained nematodes offered low predictive capacity and high dispersion, and therefore cannot be considered suitable techniques. In contrast, staining with Bengal rose significantly improved the performance of both methodologies, as it immobilized the individuals and provided a characteristic signal around 550 nm. Likewise, sample lysis reduced the overlap between individuals, improving the linearity of the response. The combination of both strategies (staining and lysis) applied to spectrophotometry proved to be the optimal condition, achieving a very high predictive power (R² = 0.97) and representing the most robust and reliable alternative to manual counting. This study demonstrates that, although image analysis can be useful as a preliminary approach, it is spectrophotometry of lysed and stained samples that offers the highest precision, reproducibility, and scalability. These findings lay the groundwork for the development of automated methods for the quantification of Caenorhabditis elegans, capable of replacing manual counting in high-demand experimental settings.

Vilanova Candel, I. (2025). Desarrollo de un método sencillo y rápido para el recuento de C. elegans mediante espectrofotometría y/o análisis de imágenes. https://riunet.upv.es/handle/10251/228767

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