Incubation time induce damages in sperm cells by necrosis and/or apoptosis. The aim of this study was the evaluation of changes in plasma membrane related to apoptosis and necrosis in bovine sperm cells through 2 hours of incubation. Sperm cells were incubated at 5% (v/v) CO2 in air for 0, 30, 60, 90 and 120 minutes. After each period, sperm cells were incubated with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide (PI) to detect change in plasma membrane related to apoptosis and necrosis respectively. Using Yo-pro/PI assay, three different subpopulations of sperm cells were detected by flow cytometry: a) necrotic sperm cells (PI+ and Yo-pro-/+); b) apoptotic sperm cells (Yo-pro+ and PI-) and c) living cells (Yo-pro- and PI-). The percentage of live cells (plasma membrane integrity) significantly decreases over 2 hour of incubation, on the other hand, the percentage of necrotic and apoptotic cells increase during incubation. Changes in plasma membrane integrity were correlated to incubation time. While live cells were negatively correlated with the increase of incubation time, necrosis and apoptosis were positively correlated. It was also observed that necrosis was the main damage in sperm cells in all incubation times. In conclusion, incubation time induces changes in plasma membrane integrity related to necrosis and apoptosis, whether necrosis is present in higher quantity in all incubation times. | O tempo de incubação causa danos nas células espermáticas relacionados a necrose e/ou apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar as mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e necrose em espermatozóides bovinos durante 2 horas de incubação. Os espermatozóides foram incubados a 5% (v/v) CO2 em ar por 0, 30, 60, 90 e 120 minutes. Depois de cada periodo, as células espermáticas foram incubadas com as sondas fluorescentes Yo-pro e iodito de propideo (PI) para detectar mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e a necrose, respectivamente. Usando Yo-pro/PI assay, três subpopulações diferentes de células espermáticas são detectadas pelo citômetro de fluxo: a) células espermáticas em necrose (PI+ and Yo-pro-/+); b) células espermáticas em apoptose (Yo-pro+ and PI-) e c) células espermáticas vivas (Yo-pro- and PI-). A porcentagem de células vivas (membrana plasmática integra) significativamente diminui durante 2 horas de incubação, por outro lado, a porcentagem de espermatozóides em necrose e apoptose aumentaram durante a incubação. As mudanças na integridade da membrana plasmática foram correlacionadas com o tempo de incubação. Enquanto as células vivas foram correlacionadas negativamente com o aumento do tempo de incubação, necrose e apoptose foram correlacionadas positivamente. Também foi observado que necrose foi o principal dano causado pelo tempo de incubação nas células espermáticas. Conclui-se que o tempo de incubação causa alteração na integridade da membrana plasmática relacionadas a necrose e apoptose nas células espermáticas, sendo que necrose foi observada em maior quantidade em todos os tempos de incubação.

Protaminas (PRM) são as principais proteínas ligantes do DNA espermático e podem compactar o núcleo do espermatozoide em menos de 5% do volume de uma célula somática. Já se sabe que o touro produz apenas a PRM1 em espermatozoide maduro, enquanto a maioria dos mamíferos também produz a PRM2. As proteínas nucleares de transição (Tnps) e as PRMs são fundamentais para a integridade do DNA. Já foi descrita a influência das protaminas na estrutura da cromatina e a associação destas com a fertilidade. Entretanto, os mecanismos moleculares que geram mudanças na cromatina espermática são desconhecidos. A expressão relativa da PRM1, PRM2, PRM3, Tnp1 e Tnp2 foi determinada para dez testículos de touros oriundos de matadouros comerciais, utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real, com primers específicos para bovinos e a β-actina como controle endógeno. Ao quantificar a expressão relativa do RNAm, detectou-se alta expressão relativa da PRM1, em comparação aos outros genes. A expressão relativa da PRM3 foi a menor de todos os genes. Foram encontradas correlações positivas e significantes (p < 0,05) entre PRM1 e PRM2 (r = 0,518), PRM2 e Tnp1 (r = 0,750), PRM2 e Tnp2 (r = 0,706), PRM3 e Tnp1 (r = 0,542), PRM3 e Tnp2 (r = 0,731) e entre Tnp1 e Tnp2 (r = 0,820). Visto que a maioria dos conhecimentos sobre a PRM2 estão baseados em um trabalho de 1990 e, de acordo com recentes estudos se sabe que a PRM1 e a PRM2 são importantes para a fertilidade do touro, mais estudos são necessários para determinar a real função das protaminas em touros. | Protamines (PRM) are the major DNA-binding proteins in the sperm nucleus and can pack the DNA into less than 5% of the volume of a somatic cell nucleus. It is already known that bulls only have the PRM1 protein on mature spermatozoa while most mammals also have the PRM2. Transition nuclear proteins (Tnps) and PRMs are fundamental to DNA integrity. It has already been reported the influence of PRM on chromatin structures, generating low fertility. However, molecular mechanisms underlying these effects are not known. The relative expression of PRM1, PRM2, PRM3, Tnp1 and Tnp2 was determined by real time RT-PCR, using bovine specific primers and β-actin as endogenous control. Quantification of mRNA relative expression showed a higher expression of PRM1 compared to the other genes. The PRM3 mRNA had the lowest relative expression. A significant (p < 0.05) and positive correlation was found between PRM1 and PRM2 (r = 0.518), PRM2 and Tnp1 (r = 0.750), PRM2 and Tnp2 (r = 0.706), PRM3 and Tnp1 (r = 0.542), PRM3 and Tnp2 (r = 0.731) and between Tnp1 and Tnp2 (r = 0.820). Since most of the knowledge about protamine 2 in bovine is based on a work from 1990 and according to new studies we know that PRM1 and PRM2 are important to bull fertility, more research is needed to elucidate the real function of protamines on bovines.

Solar radiation is responsible for bull body temperature elevation. An alternative to minimize heat stress is to use artificial shade. Thus, this study aimed to evaluate the effect of thermal stress reduction, through shade availability, on reproductive characteristics of Nellore bulls (Bos indicus). For this, ten bulls were divided in: Available artificial shade (AS, n = 5) and Unavailable shade (US, n = 5). Each group was kept in two hectare paddocks, in which shade availability for group AS was artificially created. Animals were submitted to a clinical-reproductive evaluation and seminal analyses. No interaction was observed between treatments (AS and US) and time (8 collections) for all analyzed variables (P>0.05). No significant effect (P > 0.05) of treatment was observed for all parameters analyzed. So, it can be concluded that the absence of shaded areas during summer does not negatively affect reproductive characteristics such as: scrotal circumference, testicular consistency, progressive motility, percentage of rapidly moving cells (Computer Assisted Semen Analysis - CASA), morphology or sperm viability in Nellore bulls raised in southeastern Brazil, considering that results could be different in other regions of the country where average temperature is higher. | A radiação solar é responsável pelo aumento da temperatura corpórea em touros. Uma alternativa para minimizar o estresse térmico é usar sombreamento artificial. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da redução do estresse térmico através da disponibilização de sombra artificial, sobre características reprodutivas de touros da raça Nelore (Bos indicus). Para isso, dez touros foram divididos em: Disponibilidade de sombra artificial (AS, n = 5) e Não-disponibilidade de sombra artificial (US, n=5). Cada grupo foi mantido em piquete de dois hectares cada, no qual a sombra para o grupo AS foi criada artificialmente. Os animais foram submetidos a avaliações clínicas-reprodutivas e análise seminal. Nenhuma interação foi observada entre os tratamentos (AS e US) e o tempo (8 coletas), para todas as variáveis analisadas (P > 0.05). Nenhum efeito significativo (P>0.05) de tratamento foi observado para os parâmetros analisados. Dessa forma, concluiu-se que a ausência de áreas sombreadas, durante o verão, não afetou negativamente as características reprodutivas como: circunferência escrotal, consistência testicular, motilidade progressiva, percentagem de células com movimentos rápidos (Computer Assisted Semen Analisys - CASA), morfologia e viabilidade espermática em touros da raça Nelore criados na região sudeste do Brasil, considerando que esse resultado pode ser diferente em outras regiões do país, onde as temperaturas ambientais são mais elevadas.