Brucellosis is a serious zoonotic endemic disease in more than 170 regions worldwide. It is primarily a reproductive disease affecting human and animal health, and its effects can damage producers, and regional and national economies. In Mexico, cattle are a vital protein source and a substantial portion of the livestock sector. As an alternative animal protein source, water buffalo Bubalus bubalis was introduced to Mexico in the early 1990s and is now grown in almost all its states. However, more than 30 yr after its introduction, minimal data is available on brucellosis epidemiology in this species. Brucella spp. serological frequency in water buffalo from the states of Campeche, Tabasco, and Oaxaca, Mexico, was estimated using a cross-sectional study with non-probabilistic sampling. A total of 825 animals from eighteen herds were sampled. Screening was done using the Rose Bengal card test and confirmation with a Rivanol test. Frequencies were calculated by state and municipality. Overall frequency was 4 % with the card test and 3 % with Rivanol. All three states had seropositive cases, and 66.6 % of the sampled production units had seropositive buffalo. This constitutes the first report for the states of Campeche and Oaxaca. Although Brucella spp. seroprevalence can change over time and responds to multiple variables, the identification of seropositive animals in an eradication zone (Campeche) is serious given the current active nationwide campaign against brucellosis. | La brucelosis es una enfermedad zoonótica muy importante, considerada endémica en más de 170 regiones a nivel mundial, es una enfermedad primordialmente reproductiva que afecta la salud humana y animal, así mismo, afecta la economía nacional. Los bovinos son una fuente de proteína importante en México y el búfalo de agua es una alternativa para la demanda de proteína animal. En México, el búfalo fue ingresado en los años noventa y tiene presencia en casi todos los estados. Sin embargo, después de 30 años de ser ingresado a México se desconoce su situación epidemiológica frente a brucelosis. El objetivo fue estimar la frecuencia serológica de Brucella spp. en búfalos de agua de los estados de Campeche, Tabasco y Oaxaca, México. Se realizó un estudio transversal con muestreo no probabilístico, en el cual se analizaron 825 búfalos de agua originarios de 18 hatos bufalinos de dichos estados. Se realizaron pruebas de tarjeta como tamiz y rivanol como confirmatoria, se calcularon las frecuencias por estado y municipio. La frecuencia general fue de 4 % para la prueba de tarjeta y 3 % con rivanol, los tres estados tuvieron seropositivos y el 66.6 % de la UPB fueron seropositivas. La seroprevalencia puede cambiar a lo largo del tiempo y está relacionada con múltiples variables; sin embargo, el hallazgo de animales seropositivos en zona de erradicación es de importancia sanitaria, debido a que esta enfermedad se encuentra en campaña a nivel nacional.