O presente trabalho é referente ao estágio realizado no Laboratório Veterinário Cedivet, no âmbito do Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Este relatório pretende descrever todas as atividades realizadas durante o estágio em cada área da medicina veterinária que o laboratório integra, entre as quais bioquímica, hematologia, coagulação, serologia, análise de urina e microbiologia. O Laboratório Veterinário Cedivet tem como função proceder à análise de amostras biológicas de várias espécies de animais dos diferentes hospitais e clínicas veterinárias, para facilitar o diagnóstico de diferentes patologias. Este estágio curricular teve como objetivo geral, a integração de conhecimentos teóricopráticos pré-adquiridos ao longo do mestrado, através do contacto e execução das várias atividades laboratoriais, bem como na aprendizagem de novos conceitos e técnicas relacionadas com a patologia clínica na área da medicina veterinária. No laboratório veterinário onde realizei o estágio efetuam-se análises aos diferentes parâmetros da bioquímica e endocrinologia, nomeadamente albumina, fosfatase alcalina, ureia, t4 total, cortisol, entre outros. No setor de hematologia, realiza-se o estudo dos vários constituintes do sangue, através da análise pelo hemograma e aperfeiçoamento de técnicas manuais, com a realização de esfregaços sanguíneos. Na área da Serologia inclui-se a realização de diferentes métodos de avaliação, mais precisamente, o ensaio imunoenzimático (ELISA) e imunofluorescência indireta (IFI) para a determinação dos diferentes agentes infeciosos, nomeadamente Leishmania spp., Babesia canis e Dirofilaria immitis. No setor da análise de urina consta a avaliação de características físicas, parâmetros bioquímicos e análise microscópica do sedimento urinário. A análise do sedimento permite uma maior capacidade prática na identificação e quantificação dos diferentes elementos figurados na urina, cuja presença ou ausência em quantidades anormais está associada a determinadas situações pat ológicas. Por fim, na área da microbiologia foi possível a manipulação dos diferentes produtos biológicos, sementeira nos diferentes meios de cultura, interpretação das culturas bacteriológicas e contacto com os testes de suscetibilidade a antimicrobianos manuais pelo método Kirby-Bauer. Durante o estágio tive a oportunidade de executar os vários procedimentos integrados na rotina laboratorial, nas diferentes fases do processo laboratorial, tais como a manutenção diária e semanal dos equipamentos, preparação de reagentes e a reconstituição dos controlos de qualidade e calibradores. Numa fase pré-analítica foi também possível interagir com a triagem dos tubos para posterior análise laboratorial, o que permitiu uma maior familiarização com a escolha do material de colheita para as determinadas análises dos diferentes setores. Por outro lado, foi também possível um conhecimento mais aprofundado dos equipamentos e metodologias analíticas para o estudo dos parâmetros/produtos analisados nos diferentes setores. Por fim, a escrita deste relatório permitiu ainda a compreensão da interação entre as diferentes áreas do laboratório no diagnóstico de doenças. | This work refers to the internship carried out at the Cedivet Veterinary Laboratory, within the scope of the Master's Degree in Clinical Laboratory Biology at the University of Trás-osMontes e Alto Douro. This report intends to describe all the activities carried out during the internship in each area of veterinary medicine that the laboratory integrates, including biochemistry, hematology, coagulation, serology, urine analysis and microbiology. The Cedivet Veterinary Laboratory's function is to analyze biological samples from various species of animals from different hospitals and veterinary clinics, to facilitate the diagnosis of different pathologies. This curricular internship had as its general objective the integration of theoretical-practical knowledge pre-acquired throughout the master's degree, through contact and execution of various laboratory activities, as well as learning new concepts and techniques related to clinical pathology in veterinary Medicine. In the veterinary laboratory where I carried out the internship, analyzes are carried out on different biochemistry and endocrinology parameters, namely albumin, alkaline phosphatase, urea, total t4, cortisol, between others. In the hematology sector, the various constituents of blood are studied, through blood count analysis and the improvement of manual techniques with blood smears. The area of Serology includes carrying out different evaluation methods, more precisely, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescence (IFI) for the determination of different infectious agents, namely Leishmania spp., Babesia canis and Dirofilaria immitis. The urinalysis sector includes the evaluation of physical characteristics, biochemical parameters, and microscopic analysis of urinary sediment. Sediment analysis allowed greater practical capacity in the identification and quantification of the different elements found in urine, whose presence or absence in abnormal quantities is associated with certain pathological situations. Finally, in microbiology, it was possible to manipulate different biological products, sow them in different culture media interpret bacteriological cultures and experience manual antimicrobial susceptibility tests using the Kirby-Bauer method. VI During the internship I had the opportunity to perform the various procedures integrated into the laboratory routine, in the different phases of the laboratory process, such as daily and weekly maintenance of equipment, preparation of reagents and the reconstitution of quality controls and calibrators. In a pre-analytical phase, it was also possible to interact with the sorting of tubes for subsequent laboratory analysis, which allowed greater familiarity with the choice of collection material for the specific analyzes of the different sectors. On the other hand, it was also possible to gain deeper knowledge of equipment and analytical methodologies for the study of parameters/products analyzed in different sectors. Finally, writing this report also allowed the understanding of the interaction between different areas of the laboratory in the diagnosis of diseases.

Ilustraciones, gráficas | El tomate (Solanum lycopersicum L.) representa uno de los cultivos hortícolas de mayor repercusión socio-económica a nivel mundial, uno de los factores más limitantes en su producción son los problemas fitosanitarios como la enfermedad del Nudo Radical causada por un complejo de nematodos del género Meloidogyne (M. incognita, M. javanica y M. arenaria), su manejo se realiza combinando prácticas culturales, genéticas, biológicas y químicas, siendo este último el más empleado por los agricultores. Sin embargo, han ido perdiendo efectividad, incrementan el riesgo de contaminación medioambiental y toxicidad para humanos, siendo la mayoría de los nematicidas restringidos o prohibidos. Adicionalmente, existe escasa disponibilidad de materiales genéticamente resistentes y desconocimiento o uso ineficiente y limitado de controladores biológicos. El uso de inductores de resistencia se considera una estrategia promisoria para su manejo, la cual se basa en la estimulación de los mecanismos intrínsecos de defensa de los tejidos. Han sido evaluados por su efecto en la inducción de la actividad de enzimas relacionadas con la defensa y protección de plantas, los ácidos orgánicos, extractos de algas y plantas, quitosano y organismos benéficos como hongos y bacterias, muchos de ellos tienen además efecto directo sobre el desarrollo de organismos fitopatógenos. Una de las macrotendencias de la agricultura a nivel mundial es diseñar sistemas de cultivos más amables con el ambiente que utilicen métodos sostenibles de manejo de plagas y enfermedades junto con estrategias de alimentación que promuevan el cuidado por el medio ambiente, así como, desarrollar prácticas de cultivos innovadoras y más competitivas. De acuerdo con lo anterior, se hace necesario generar conocimiento para mejorar los programas de manejo integrado de nematodos a partir de herramientas como los inductores de resistencia. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del quitosano y de bacterias nativas de la región de Caldas en Colombia, sobre el nematodo nodulador de la raíz, Meloidogyne spp. en tomate (Solanum lycopersicum L.), mediante el uso de quitosano y bacterias nativas. El experimento se desarrolló en cuatro etapas, en la primera, se estudió el efecto in vitro de quitosano de bajo peso molecular en dosis de 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 mg.mL-1 y de las bacterias rizosféricas nativas de la región de Caldas (Bacillus infantis, B. pumilus, Paraburkholderia tropica, Serratia marcescens y S. grimesii 1x108 UFC/mL), provenientes de la Colección de Microorganismos de la Universidad Católica de Manizales. Las variables evaluadas fueron, el efecto nematicida en juveniles (% mortalidad), efecto nematostático en juveniles (% movilidad), porcentaje de inhibición en la eclosión de huevos. Los resultados del efecto de los tratamientos sobre la inhibición de la eclosión de Meloidogyne spp., muestran que se obtuvo mejor respuesta con los tratamientos de quitosano en dosis de 1,0 mg.mL-1, y con la bacteria P. tropica en los tres momentos de evaluación, con un porcentaje de inhibición del 90% de los juveniles de Meloidogyne sp. Mientras que a partir de los resultados obtenidos en la evaluación de los efectos nematicida y nematostático sobre Meloidogyne en estado juvenil 2 (J2), se observa que el tratamiento con Serratia marsecens (82% de nematicida) y con Serratia grimesii (65% de nematicida) son los más efectivos. Ambos tratamientos presentaron altos niveles de inmovilización de los nematodos (82% y 87%, respectivamente). En la segunda, se evaluó su efecto sobre cuatro genotipos de tomate: dos tipo cherry (IAC1687 y LA2076) y dos tipo chonto comerciales, considerados resistente (R) y susceptible (S), en condiciones de campo hasta producción; se evaluó el crecimiento y desarrollo de las plantas, el rendimiento y la población de nematodos. Encontrando que el tratamiento que tuyo mayor porcentaje de reduccion en la poblacion fue la aplicación foliar de Serratia marcescens en el genotipo IAC1687 con un total de 93%, así mismo Serratia marcescens obtuvo un 90% de control sobre la reducción de la población en aplicación foliar sobre el testigo resistente, un 80 % de control con Bacillus infantis en aplicación edáfica en el testigo resistente, para el caso del testigo susceptible Paraburkholderia tropica presentó un 72% de control en aplicación, frente al testigo sin aplicación. Teniendo presente la respuesta diferencial mediada por el genotipo y la forma de aplicación, para continuar con la tercera y cuarta fase se seleccionaron aquellos tratamientos que representaran menor riesgo de bioseguridad en su uso y una respuesta positiva en el material susceptible, para evaluar la activación de mecanismos de defensa en un material susceptible y con alto porcentaje de siembra a nivel comercial. En la tercera se seleccionaron dos dosis de quitosano 2.0 y 2.5 mg/mL y dos bacterias Paraburkholderia tropica y Bacillus infantis, para evaluar la inducción de enzimas asociadas a respuestas de defensa como la quitinasa y la endoglucanasa en plántulas de tomate susceptible, encontrado que P. tropica y B. infantis, mostraron una inducción de los nieveles de endoglucanasas estadísticamente significativa, en la respuesta a quitinasas P. tropica mostró inducción en los cuatro momentos evaluados, siendo estadísticamente diferente de B. infantis. Quitosano 2.5 mg/mL mostró una mayor actividad de inducción de quitinasa. Los tratamientos mostraron una reducción significativa en la población de nematodos en comparación con el control inoculado con el patógeno. Finalmente, para la cuarta etapa, se seleccionó el mejor tratamiento o la alternativa más novedosa de acuerdo a la síntesis de las fases o etapas anteriores, destacando así el efecto de Paraburkholderia tropica sobre plantas susceptibles de tomate chonto y la activación de ambas enzimas, se realizó una evaluación de las respuestas transcripcionales inducidas por P. tropica, Meloidogyne spp. o por los dos agentes en tomate susceptible, mediante RNA-seq. Se implementó un proceso de descubrimiento de transcritos, que permitió la identificación de 2283 supuestas transcripciones novedosas. El análisis de expresión diferencial reveló que las transcripciones reguladas positivamente eran mucho más numerosas que las reguladas negativamente. A nivel de ontología genética, el término más activado fue "actividad hidrolasa que actúa sobre enlaces éster" en todos los grupos. Además, cuando ambos microbios fueron inoculados juntos, se activó la "actividad hidrolasa que actúa sobre los compuestos O-glicosilo". Esto sugiere respuestas de defensa relacionadas con el metabolismo de lípidos y carbohidratos, la remodelación de membranas y la transducción de señales. Destacaron los genes de defensa, los factores de transcripción y las proteínas quinasas. Las transcripciones expresadas diferencialmente sugieren que se produjo la activación de una respuesta de defensa multifacética de la planta contra el nematodo, que fue exacerbada por la preinoculación de P. tropica. | Abstract Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most socio-economically significant horticultural crops worldwide. One of the most limiting factors in its production is phytosanitary issues, such as root-knot disease caused by a complex of nematodes from the Meloidogyne genus (M. incognita, M. javanica, and M. arenaria). Management of this disease involves a combination of cultural, genetic, biological, and chemical practices, with the latter being the most commonly used by farmers. However, chemical control methods have been losing effectiveness, increasing the risk of environmental contamination and toxicity to humans, leading to the restriction or prohibition of most nematicides. Additionally, there is limited availability of genetically resistant materials and a lack of knowledge or inefficient and limited use of biological control agents. The use of resistance inducers is considered a promising strategy for nematode management, as it stimulates the plant’s intrinsic defense mechanisms. Various inducers have been evaluated for their ability to activate plant defense-related enzymes, including organic acids, algae and plant extracts, chitosan, and beneficial organisms such as fungi and bacteria, many of which also have direct effects on the development of phytopathogens. A global trend in agriculture is the design of more environmentally friendly cropping systems that integrate sustainable pest and disease management methods alongside feeding strategies that promote environmental care while developing innovative and more competitive farming practices. In this context, generating knowledge to improve integrated nematode management programs using resistance inducers is necessary. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of chitosan and native bacteria from the Caldas region in Colombia on the root-knot nematode Meloidogyne spp. in tomato (Solanum lycopersicum L.). The experiment was conducted in four stages. In the first stage, the in vitro effect of low-molecular-weight chitosan at doses of 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, and 2.5 mg/mL and rhizospheric bacteria native to the Caldas region (Bacillus infantis, B. pumilus, Paraburkholderia tropica, Serratia marcescens, and S. grimesii at 1x10⁸ CFU/mL) from the Microorganism Collection of Universidad Católica de Manizales was studied. The evaluated variables included nematicidal effect on juveniles (% mortality), nematostatic effect on juveniles (% mobility), and percentage inhibition of egg hatching. The results showed that the treatments with chitosan at 1.0 mg/mL and P. tropica at all evaluation times exhibited the best responses, achieving a 90% inhibition rate of Meloidogyne sp. juveniles. Additionally, in terms of nematicidal and nematostatic effects on second-stage juveniles (J2), S. marcescens was the most effective (82% nematicidal effect), followed by S. grimesii (65% nematicidal effect). Both treatments also showed high levels of nematode immobilization (82% and 87%, respectively). In the second stage, their effect was evaluated on four tomato genotypes: two cherry types (IAC1687 and LA2076) and two commercial chonto types, classified as resistant (R) and susceptible (S), under field conditions up to the production stage. Plant growth and development, yield, and nematode populations were assessed. The highest reduction in nematode populations was observed with foliar application of S. marcescens in genotype IAC1687 (93% reduction). Similarly, S. marcescens achieved 90% control when applied foliarly to the resistant genotype, while B. infantis achieved 80% control when applied to the soil in the resistant genotype. For the susceptible genotype, P. tropica achieved 72% control through foliar application compared to the untreated control. Given the differential response mediated by genotype and application method, the third and fourth phases focused on selecting treatments with lower biosafety risks and a positive response in the susceptible material, aiming to evaluate defense mechanism activation in a commercially relevant susceptible genotype. In the third stage, two chitosan doses (2.0 and 2.5 mg/mL) and two bacteria (P. tropica and B. infantis) were selected to evaluate the induction of defense-related enzymes such as chitinase and endoglucanase in susceptible tomato seedlings. The results showed that P. tropica and B. infantis significantly induced endoglucanase activity. In the case of chitinase, P. tropica exhibited induction at all four evaluation times, showing a statistically significant difference compared to B. infantis. Chitosan at 2.5 mg/mL showed the highest chitinase induction activity. The treatments significantly reduced nematode populations compared to the pathogen-inoculated control. Finally, in the fourth stage, the most innovative treatment was selected based on the synthesis of previous stages, highlighting the effect of P. tropica on susceptible chonto tomato plants and the activation of both enzymes. A transcriptional response evaluation was conducted using RNA-seq to study the responses induced by P. tropica, Meloidogyne spp., or both agents in susceptible tomato plants. A transcript discovery process identified 2,283 putative novel transcripts. Differential expression analysis revealed that positively regulated transcripts were much more abundant than negatively regulated ones. At the gene ontology level, the most activated term was "hydrolase activity acting on ester bonds" in all groups. Additionally, when both microbes were inoculated together, "hydrolase activity acting on O-glycosyl compounds" was activated, suggesting defense responses related to lipid and carbohydrate metabolism, membrane remodeling, and signal transduction. Defense-related genes, transcription factors, and kinase proteins were prominent. The differentially expressed transcripts suggest that a multifaceted plant defense response against the nematode was activated and further enhanced by P. tropica pre-inoculation. | RESUMEN / CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN / 1.1 Objetivos / 1.1.1 General / 1.1.2 Específicos / 1.2 Bibliografía / CAPÍTULO 2. REVISIÓN DE LITERATURA / 2.1 Marco teórico / 2.1.1. El cultivo de tomate / 2.1.2 Nematodos fitoparásitos / 2.1.3 Meloidogyne spp. Chitwood (nematodo del Nudo radical) / 2.1.4 Diagnóstico de nematodos / 2.1.5 Manejo de nematodos / 2.1.6 Respuestas de defensa / 2.1.7 Quitosano / 2.1.8 Bacterias rizosféricas / 2.1.8.1 Bacillus infantis / 2.1.8.2 Bacillus pumilus / 2.1.8.3 Serratia grimesii / 2.1.8.4 Serratia marcescens / 2.1.8.5 Paraburkholderia tropica / 2.2. Bibliografía / CAPITULO 3. Bioprospección in vitro a partir de quitosano y bacterias nativas sobre el Nematodo del Nudo Radical (Meloidogyne spp.) del tomate (Solanum lycopersicum L.) / 3.1 Resumen / 3.2 Introducción / 3.3 Materiales y métodos / 3.1.1 Localización / 3.1.2 Tratamientos evaluados / 3.1.4 Inóculo de Meloidogyne spp. / 3.1.5 Evaluación en huevos / 3.1.6 Evaluación en juveniles 2 (J2) / 3.1.7 Variables evaluadas / 3.1.8 Diseño experimental / 3.2 Resultados y discusión 82 3.2.1 Inhibición de la eclosión 82 3.2.1 Mortalidad de juveniles 2 de Meloidogyne después de 24, 48 y 72 horas de exposición a bacterias y quitosano / 3.2.3 Porcentaje del efecto nematicida y nematostático / 3.3 Conclusión / 3.4 Bibliografía / CAPITULO 4. Chitosan: an alternative for the integrated management of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in tomato production systems / 4.1 Abstract / 4.2 Introduction / 4.3. Materials and methods / 4.3.1 Location / 4.3.2 Plant material / 4.3.3 Plant distribution / 4.3.4 Obtaining the eggs and juveniles of Meloidogyne spp. / 4.3.5 Treatments with chitosan / 4.3.6 Experimental design 98 4.3.7 Variables evaluated / 4.3.8 Statistical analysis / 4.4 Results / 4.4.1 Chitosan soil application in tomato cherry genotypes IAC1687 and LA2076 100 4.4.2 Chitosan soil application in tomato chonto resistant and susceptible / 4.4.3 Chitosan foliar application in tomato cherry genotypes IAC1687 and LA2076 / 4.4.4 Chitosan foliar application in tomato chonto resistant and susceptible / 4.5. Discussion / 4.6 Conclusions / 4.7 References / CAPÍTULO 5. Respuesta de los componentes del rendimiento en tomate (Solanum lycopersicum L.) y la reducción de la población del nematodo agallador (Meloidogyne spp.) con la aplicación de bacterias nativas / 5.1 Resumen / 5.2 Introducción / 5.3 Materiales y métodos / 5.3.1 Ubicación / 5.3.2 Material vegetal. /5.3.3 Diseño experimental / 11 5.3.4 Obtención de huevos y juveniles de Meloidogyne spp / 5.3.5 Tratamiento con bacterias / 5.3.6 Tipo de aplicación / 5.3.7 Variables evaluadas / 5.3.8 Análisis estadístico / 5.4 Resultados y Discusión / 5.4.1 Aplicación foliar y edáfica de bacterias en genotipos de tomate silvestre / 5.5 Conclusiones / 5.6 Bibliografia / CAPÍTULO 6. Induction of endoglucanases and chitinases by application of chitosan and the bacteria Paraburkholderia tropica and Bacillus infantis in tomato (Solanum lycopersicum L.) inoculated with Meloidogyne spp / 6.1 Abstract / 6.2 Introduction / 6.2.1 Tomato Cultivation / 6.2.2 Meloidogyne spp. / 6.2.3 Methods of Nematode Management / 6.2.4 Rhizospheric Bacteria / 6.2.5 Chitosan / 6.2.6 Induction of Defense Mechanisms in Plants / 6.3 Materials and Methods / 6.3.1 Localization / 6.3.2 Plant material / 6.3.4 Experimental desing / 12 6.3.4 Obtaining Meloidogyne spp / 6.3.5 Bacterial strains / 6.3.6 Chitosan dose / 6.3.7 Evaluation of Enzyme Activity / 6.3.8 Measurement of endoglucanase and chitinase activity / 6.3.9 Nematode population / 6.3.10 Statistical analysis / 6.4 Results and Discussion / 6.5 Conclusion / 6.6 Bibliography / CAPÍTULO 7. Paraburkholderia tropica primes a multilayered transcriptional defense response to the nematode Meloidogyne spp. in tomato / 7.1 Abstract / 7.2 Introduction / 7.3.1 Discovery of putative novel transcripts / 7.3.2 Differentially expressed transcripts / 7.3.3 Transcriptional plant responses to P. tropica alone / 7.3.4 Transcriptional plant responses to Meloidogyne spp. alone / 7.3.5 Transcriptional plant responses induced by P. tropica and Meloidogyne spp. / 7.3.6 Overlapping differentially expressed transcripts among treatments / 7.3.7 Protein functional categories differentially expressed / 7.3.7 Differentially expressed novel transcripts / 7.3.8 Distribution of differentially expressed transcripts along chromosomes / 7.4 Discussion / 7.5 Conclusions / 7.6 Materials and methods / 7.6.1 Location / 7.6.2 Plant material / 7.6.3 Paraburkholderia tropica inoculum / 7.6.4 Inoculum of Meloidogyne spp. / 7.6.5 Evaluated treatments / 7.6.6 Library construction and sequencing / 7.6.7 Quality control / 7.6.8 Transcriptome assembly / 7.6.9 Transcript quantification and differential expression analysis / 7.6.10 Gene ontology analysis / 7.7. References / CAPÍTULO 9. DISCUSIÓN / 10. CONCLUSIONES / 11. ANEXOS | Doctorado | El experimento se desarrolló en cuatro etapas, en la primera, se estudió el efecto in vitro de quitosano de bajo peso molecular en dosis de 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 mg.mL-1 y de las bacterias rizosféricas nativas de la región de Caldas (Bacillus infantis, B. pumilus, Paraburkholderia tropica, Serratia marcescens y S. grimesii 1x108 UFC/mL), provenientes de la Colección de Microorganismos de la Universidad Católica de Manizales. Las variables evaluadas fueron, el efecto nematicida en juveniles (% mortalidad), efecto nematostático en juveniles (% movilidad), porcentaje de inhibición en la eclosión de huevos. En la segunda, se evaluó su efecto sobre cuatro genotipos de tomate: dos tipo cherry (IAC1687 y LA2076) y dos tipo chonto comerciales, considerados resistente (R) y susceptible (S), en condiciones de campo hasta producción; se evaluó el crecimiento y desarrollo de las plantas, el rendimiento y la población de nematodos. En la tercera se seleccionaron dos dosis de quitosano 2.0 y 2.5 mg/mL y dos bacterias Paraburkholderia tropica y Bacillus infantis, para evaluar la inducción de enzimas asociadas a respuestas de defensa como la quitinasa y la endoglucanasa en plántulas de tomate susceptible. Finalmente, para la cuarta etapa, se seleccionó el mejor tratamiento o la alternativa más novedosa de acuerdo a la síntesis de las fases o etapas anteriores, destacando así el efecto de Paraburkholderia tropica sobre plantas susceptibles de tomate chonto y la activación de ambas enzimas, se realizó una evaluación de las respuestas transcripcionales inducidas por P. tropica, Meloidogyne spp. o por los dos agentes en tomate susceptible, mediante RNA-seq. | Doctor(a) en Ciencias Agrarias | Fitopatología