Células multipotentes da geleia de Wharton de cordões umbilicais ovinos: uma ferramenta para o cultivo, diagnóstico, replicação viral e produção de antígenos de lentivírus de pequenos ruminantes

Portuguese. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. Orientadora: Maria Fátima da Silva Teixeira; Coorientador: Raymundo Rizaldo Pinheiro.

Resumo: A Geleia de Wharton (GW) é um tecido conectivo mucoso constituído de células mesenquimais imersas em uma substância de base, localizada em torno dos vasos sanguíneos do cordão umbilical. Na primeira fase desse trabalho, foram investigadas as melhores condições de transporte e cultivo para o tecido e células da GW ovinas, caracterizando-as como células multipotentes. Na segunda fase, o trabalho descreveu a permissividade destas células aos lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR). Na terceira fase foram produzidos dois antígenos para o teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) em células da GW de cordão umbilical ovino cultivadas em DMEM baixa glicose, infectadas in vitro com CAEV-Cork ou MVV-K1514, com análise da sensibilidade de detecção de anticorpos anti-CAEV. Para tanto, dez cordões umbilicais foram coletados de ovelhas hígidas por ocasião do parto natural. Foram realizadas culturas de explantes da GW e investigada a viabilidade em cada meio pelo método MTT, além da indução à diferenciação adipogênica, condrogênica e osteogênica in vitro. A permissividade da infecção das células GW ovina foi testada frente às cepas CAEV-Cork e MVV-K1514 quanto ao efeito citopático. Foram obtidos quatro sobrenadantes contento partículas virais CAEV-Cork e quatro MVV-K1514, provenientes do cultivo por 21 dias em meios distintos (MEM, DMEM baixa glicose, Meio 199 e RPMI), os quais foram destinados à nested-PCR e titulação viral. Destes, dois antígenos foram preparados a partir dos sobrenadantes virais CAEV-Cork e MVV K-1514 cultivados em DMEM baixa glicose por concentração em AMICON e liofilização. Foram avaliados quanto à sensibilidade e especificidade, utilizando-se 199 soros caprinos analisados previamente por Western Blot e por um kit OPPV/CAEV comercial. As células apresentaram morfologia fibroblastóides. Os ensaios de MTT e diferenciação in vitro, revelaram que a escolha do meio de cultura influi na proliferação e manutenção da multipotência, destacando o DMEM baixa glicose como o mais efetivo. Foi demonstrada permissividade por meio da visualização de sincícios, detecção do DNA pró-viral e titulação em todos os tratamentos. A sensibilidade dos antígenos produzidos em DMEM foi de 75% tanto utilizando o CAEV como o MVV, sendo superiores ao Kit de IDGA comercial. Abstract: Wharton Jelly (WJ) is a mucosal connective tissue made up of mesenchymal cells immersed in a base substance, located around the umbilical cord blood vessels. In the first phase of this work, the best conditions of transport and culture for ovine WJ tissue and cells were investigated, characterizing them as multipotent cells. In the second phase, the work described the permissiveness of these cells to lentiviruses of small ruminants (SRLV). In the third phase two antigens were produced for the agarose gel immunodiffusion (AGID) test in ovine cord WJ cells cultured in low-glucose DMEM, infected in vitro with CAEV-Cork or MVV-K1514, with sensitivity analysis of Detection of anti-CAEV antibodies. Ten umbilical cords were collected from healthy sheep on the occasion of natural childbirth. Cultures of WJ explants were performed and viability was investigated in each medium by the MTT method, in addition to the induction to adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation in vitro. Permissiveness of ovine WJ cell infection was tested against CAEV-Cork and MVVK1514 strains for cytopathic effect. Four supernatants containing CAEV-Cork and four MVV-K1514 viral particles were obtained from the culture for 21 days in different media (MEM, DMEM low glucose, Media 199 and RPMI), which were destined for nested PCR and viral titration. Of these, two antigens were prepared from CAEV-Cork and MVV K-1514 viral supernatants cultured in low-glucose DMEM by concentration in AMICON and lyophilization. Sensitivity and specificity were evaluated using 199 goat sera previously analyzed by Western Blot and by a commercial OPPV / CAEV kit. The cells presented fibroblastomo morphology. MTT assays and in vitro differentiation revealed that the choice of culture media influences the proliferation and maintenance of multipotency, highlighting low-glucose DMEM as the most effective. Permissiveness was demonstrated through visualization of syncytia, pro-viral DNA detection and titration in all treatments. The sensitivity of the antigens produced in DMEM was 75% both using the CAEV and the MVV, being superior to the commercial AGID Kit.