Dosage immunoenzymatique (elisa) du virus de la mosaique du concombre I-Aspect methodologique

English. The ELISA test (double antibody sandwich type) can be used as a quantitative method of estimating the concentration of cucumber mosaic virus (CMV). Strictly defined experimental conditions had to be observed to obtain acceptable accuracy in the estimations. A study with purified and stabilized preparations of CMV showed much variation in the absorbance values (D.O). for the same antigen concentrat This variation, observed with both MICROELISA plates and PAK cuvettes, restricted the quantitative reliability of the method appreciably. It was possible to remedy these inconveniences partly (I) by eliminating the outer rows of wells, (II) by taking into consideration the differences between two successive recordings of absorbance values (∆ O.D.), and (III) by taking several measurements of each tested sample following a previously established loading scheme. Under these conditions, coefficients of variation were less than 10 per cent for antigen concentrations between 25 and 250 ng/ml. In this concentration range, a good linear relationship (with p = 0.01) existed between ∆ O.D. values and log antigen concentration. Therefore, a regression line fitted to data obtained from dilutions of a " standard " antigen preparation could be used in a comparative method to estimate the antigen content of an unknown sample. One " standard " was enough for each test, as the regression lines obtained in different cuvettes were generally parallel. However, lack of reliability between assays, probably due to variation in operational conditions during substrate hydrolysis, necessitated the incorporation of a " standard " into each assay.

French. Le test immunoenzymatique ELISA (type « sandwich ») peut être utilisé pour le dosage du virus de la mosaïque du concombre (CMV) à condition de se placer dans des conditions expérimentales strictement définies qui sont indispensables si l’on veut obtenir une précision acceptable dans les estimations fournies par la méthode. Une étude réalisée avec des préparations de CMV purifié stabilisé fait en effet apparaître des variations importantes dans les valeurs de densité optique (D.o.) enregistrées pour une même concentration en antigène. Les variations que l’on observe avec les deux types de support étudiés (plaques MICROELISA et cuvettes PAK) sont souvent liées à la position des puits ; elles limitent sensiblement les possibilités de dosage. Il est possible de remédier en partie à ces inconvénients en éliminant des puits situés en bordure, en prenant en considération les différences de densité optique (∆ D.o.) entre deux lectures successives et en procédant, pour chaque extrait analysé, à plusieurs mesures selon un schéma de dépôt préalablement établi (cas des cuvettes PAK). Dans ces conditions, les coefficients de variation sont inférieurs à 10 p. 100 pour des teneurs en antigène comprises entre 250 et 25 ng/ml. Dans cette gamme de concentrations, il existe une bonne corrélation linéaire (au seuil 0,01) entre les valeurs de ∆ D.o. et les log. des concentrations en virus. Ainsi, une droite de régression, établie à partir des ∆ D.o. correspondant à 4 dilutions d’une préparation antigénique « standard » permet, par comparaison, d’estimer la teneur en virus d’un extrait inconnu. Il suffit d’incorporer un seul « standard » dans chaque essai, les droites de régression établies dans plusieurs cuvettes étant en général parallèles. En revanche, la mauvaise reproductibilité de la méthode, due vraisemblablement à des variations dans les conditions d’hydrolyse du substrat, nécessite de disposer d’un « standard » dans chaque essai. En raison de l’instabilité du virus de la mosaïque du concombre, la préparation « standard utilisée dans plusieurs essais successifs doit obligatoirement être stabilisée par le formaldéhyde. Les conséquences de cette stabilisation sur le comportement du virus en ELISA sont discutées. En dépit de ces imperfections, le test immunoenzymatique ELISA apparaît comme la méthode actuellement la mieux adaptée pour le dosage rapide du virus de la mosaïque du concombre dans le cadre de l’analyse systématique d’un grand nombre d’échantillons.