Culture-independent characterisation of human faecal flora using rRNA-targeted hybridization probes

French. La comparaison des dénombrements au microscope ou par culture anaérobie de la flore fécale humaine indique l’existence d’une fraction non-cultivable importante. Nous avons utilisé l’hybridation quantitative en dot-blot pour caractériser la structure et la diversité de la flore fécale humaine par une méthode indépendante de la culture. Un ensemble de dix sondes ciblant les ARNr a permis la quantification relative des ARNr de divers groupes microbiens dans les selles de dix volontaires sains. Les trois domaines primordiaux et les groupes majeurs du domaine Bacteria ont été étudiés. Le dénombrement par culture de Bacteroides, Bifidobacterium et Escherichia coli a été comparé avec la quantification relative des ARNr correspondants. L’ARNr du domaine Bacteria a représenté 78,2 ± 4,3 % [extrêmes 59-94] de l’ARNr total. Les ARNr des domaines Archaea et Eucarya n’ont présenté qu’une contribution minime à l’ARNr total (0,28 et 2,02 %, respectivement), portant la contribution des trois domaines à 80,5 ± 4,5 % [61-100] de l’ARNr total. Deux sondes additives ciblant les Gram positifs à haut (G + C) % (HGC) et les autres bactéries (NHGC) ont reconnu 1,4 et 80,6 % de l’ARNr bactérien, respectivement. Les ARNr des Bacteroides et du groupe des entériques ont représenté 35,5 ± 4,5 % et 2,7 ± 0,7 % de l’ARNr bactérien, respectivement. Ces résultats suggéraient une contribution importante des bactéries Gram positives à bas (G + C) % (LGC) dans la flore totale. Si Bacteroides et les entériques sont bien les Gram négatifs dominants de la flore, la contribution attendue des LGC est de 47 à 67 % de l’ARNr bactérien. Une sonde reconnaissant partiellement le groupe LGC a donné une contribution s’élevant à 24 ± 5,5 % de l’ARNr bactérien. Les dénombrements par culture anaérobie se sont montré plus variables entre individus que ne l’étaient les quantifications relatives d’ARNr pour les trois groupes microbiens concernés. Les moyennes de dénombrements de Bacteroides et Bifidobacterium, exprimées en pourcent de la flore totale, étaient supérieures d’un facteur 2 aux quantités relatives d’ARNr correspondantes, suggérant une surestimation systématique de ces groupes par la culture. Cela pourrait être dû à une sous-estimation de la flore totale. Nos résultats indiquent que la culture anaérobie biaise la reconnaissance de la biodiversité réelle de l’écosystème digestif humain. Les LGC sont plus sensibles à une sous-estimation par la culture. Leur diversité et leur contribution fonctionnelle à l’écosystème digestif devront être réévaluées. L’inventaire moléculaire complet d’une flore fécale humaine, en cours dans notre laboratoire, va permettre d’avancer dans ce sens et de compléter le panel actuel de sondes d’hybridation.

English. Comparison of cultural and microscopic counts indicates that a significant fraction of human faecal flora is nonculturable. To characterise human faecal flora using quantitative dot-blot hybridisation, a set of ten ribosomal ribonucleic acid (rRNA)-targeted oligonucleotide probes were used to quantify rRNA abundance of different microbial groups within total RNA from faeces of ten individuals. The three domains and major groups of the domain bacteria were investigated. Cultural counts were compared with rRNA relative abundance for total Bacteroides, Bifidobacterium and Escherichia coli. Bacterial rRNA represented 78.2 ± 4.3 % (range 59-94) of total rRNA. The archaeal and eucaryal rRNAs only showed a minor contribution to total rRNA (0.28 and 2.02 %, respectively), the added contribution of all three domains accounting for 80.5 ± 4.5 % (range 61-100) of total rRNA. Additive probes targeting high G + C Gram-positives (HGC) and other bacteria (NHGC) hybridised with 1.4 and 80.6 % of bacterial rRNA, respectively. Total Bacteroides and enterics-group rRNAs accounted for 35.5 ± 4.5 % and 2.7 ± 0.7 % of bacterial rRNA, respectively. These results suggested a very significant contribution of low G + C Gram-positives (LGC) to total bacteria. Assuming that Bacteroides and enterics were the major Gram-negatives present, LGC could be calculated to account for 47 to 67 % of bacterial rRNA. Partial probing of LGC accounted for 24 ± 5.5 % of bacterial rRNA. Cultural counts were more variable between individual faecal samples than were rRNA relative abundances for all three groups enumerated. Average counts of Bacteroides and Bifidobacterium, expressed as percent of total anaerobes, were two-fold higher than the corresponding rRNA indices, indicating a systematic overestimation of these groups. This could be due to an underestimation of total anaerobes. Our results indicate that culture-based techniques introduce a bias in the appreciation of the biodiversity of the human gut flora. LGC are apparently more susceptible to cultural underestimation. Their diversity as well as their functional contribution to the gut ecosystem may therefore need reconsideration. A complete molecular inventory of human faecal flora, currently underway in our laboratory, and probebased technologies will certainly help to this end.