Advancing environmental biotechnologies through molecular ecology approaches: from description to management | Faire progresser les biotechnologies environnementales par le biais d'approches d'écologie moléculaire: de la description à la gestion

English. Renewable energies play a crucial role in the limitation of the CO2 emissions. Among them, anaerobic digestion allows the reduction of organic waste volume and the production of biogas, a sustainable energy. However the vulnerability of the anaerobic microbiome to the modification of operational parameters can lead to process failure and economic losses. Increasing the knowledges about the anaerobic microbiome as a whole and its impact on the digester performances would provide the keys to limit the risk of process failure. Thanks to the development of the high throughput methodologies, the understanding of the microbiome dynamics, interactions and functioning has improved.The aim of this thesis work was to characterise the microbiome functioning under different operating conditions and how it relates to the digester performances. To do so multiple high-throughput molecular technologies, especially 16S rRNA metabarcoding and metabolomics analyses, coupled to computational biostatistics were used.Influence of the feedstock composition was the first parameter studied. Digesters were fed with different mixtures of substrates. The results showed that the substrate composition played a significant role on the microbial diversity and specificity which could explain the different digester performances observed between the batch reactors. An integrative analytical framework was specifically used to link the microbial activity to the substrates degradation. It allowed to identify potential degraders of specific molecules. The capacity of the microorganisms to adapt to an modification of the feedstock composition was also evaluated in semi-continuous reactors.In a second time, the influence of ammonia accumulation on the microbial dynamics was evaluated. In semi-continuous reactors ammonia was added at different speeds. The results showed that the faster the speed of accumulation was, the more the digester performances were impacted. A longitudinal analysis was performed by carrying out a temporal sampling. This analysis allowed to evaluate the adaptation capacity of the microbes when subjected to different conditions of ammonia addition. Moreover microorganisms specific to the ammonia accumulation were identified and could be used as potential bio-indicators to forecast digester inhibition.Finally the influence of the zeolite on the microbial interactions was studied. Zeolite is a mineral support allowing to counteract ammonia inhibition. However, the mechanisms behind this mitigation capacity remain unclear. In order to unravel them, different physical treatments were applied on the zeolite before it was added into digesters containing ammonia. In general in absence of ammonia, the zeolite did not influence the microbial composition and the digester performances, while a significant effect was observed in presence of ammonia. A discriminant analysis coupled to a sparse method allowed to highlight the impact of the zeolite on the microbial syntrophy needed for the propionate degradation. Additional data from the literature were included in order to evaluate the genericity of the results.The results from this thesis work highlight the importance of the operational parameters, even at a small-scale, on the microbial activity. Innovative statistical frameworks for the analysis of the microbiome were proposed to go further on the microbiome description. For example, key phylotypes specifically sensitive to inhibition were identified. Some of them could be used as bio-indicators to control digester functioning. Moreover, this work highlights the value of developing the metabolomic analysis in the bioprocess fields, as it enables to monitor organic matter degradation and infer the potential role of the microorganisms in the degradation process.

French. L’utilisation des énergies renouvelables joue un rôle crucial dans la réduction des émissions de gaz à effet de serre. Dans ce contexte de préservation de l’environnement, la digestion anaérobie (DA) est un bioprocédé permettant la réduction du volume de déchets organiques et la production de biogaz, une énergie verte. Cependant, son développement est limité du fait de nombreuses difficultés. Un de ces obstacles est la difficulté de maintenir un procédé stable et performant. Des améliorations dans le suivi de ce bioprocédé est nécessaire, spécialement concernant la communauté microbienne. Pour le moment le suivi du bon fonctionnement du bioprocédé se base sur des analyses chimiques et l’expertise de l’exploitant. Hors le bon fonctionnement dépend principalement du fonctionnement de la communauté microbienne au sein du digesteur. En effet, la vulnérabilité du microbiome face à des modifications de paramètres opératoires peut entrainer la défaillance des exploitations, la pollution due au non traitement des déchets ainsi que des pertes économiques. La caractérisation fine de la composition du microbiome et de son fonctionnement pourrait fournir des clés pour limiter le risque d’un dysfonctionnement du bioprocédé. Pour ce faire, il est essentiel de comprendre précisément comment les paramètres techniques et chimiques du bioprocédé influencent l’équilibre microbien et identifier les procédés métaboliques qui conduisent à la défaillance du bioprocédé.Des progrès significatifs ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension du microbiote anaérobique grâce au récent développement des techniques d’analyse moléculaire à haut débit et des approches omiques. Parmi ces technologies il peut être cité le séquençage du gène codant pour l’ARN 16S. Ce gène est présent chez tous les microorganismes. Il contient des régions hypervariables permettant l’identification des différents microorganismes en comparant les séquences obtenues à des bases de données. L’analyse non ciblée du matériel génétique d’un échantillon complexe se nomme la métagénomique et permet l’étude globale du microbiome dans un échantillon à un instant t. D’autres méthodologies omiques existent, telles que la métatranscriptomique ou encore la métaprotéomique. Différents niveaux d’information concernant l’écosystème microbien sont fournis par ces techniques ce qui pourrait permettre, par exemple, de réaliser un diagnostic microbien du digesteur. Cela consisterait en un suivi d’indicateurs biologiques, qui pourraient être des enzymes, métabolites ou des microorganismes spécifiques, pour déterminer le bon fonctionnement ou le risque d’une défaillance du digesteur.Les technologies moléculaires à haut débit fournissent une quantité importante de données et extraire l’information clé de ces jeux de données n’est pas chose aisée. Les analyses biostatistiques computationnelles peuvent aider à identifier ces informations importantes. L’une des difficultés dans l’analyse statistiques est le choix de la méthode à employer parmi toutes celles existantes et qui permettrait de répondre de façon pertinente à la question biologique que l’on se pose. Cependant, de nouveaux développements sont encore nécessaires pour permettre l’analyse des données issues technologies d’analyse du microbiome et pour aller plus loin dans l’interprétation des données microbiennes obtenues. En effet, même si un grand nombre d’information est maintenant disponible sur la modification de la communauté microbienne par des paramètres340opérationnels, des questions demeurent. Par exemple : comment la composition de l’alimentation d’un digesteur influence la dynamique microbienne ? A quel niveau du bioprocédé un inhibiteur influence un digesteur (performances globales, population microbienne, fonctions exprimées, métabolites produits …) ? Est-il possible d’identifier des bio-indicateurs précoces d’une inhibition …?Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse est de déterminer comment la modification de différents paramètres influence le microbiome est comment cela impact les performances du digesteur. Pour cela, différentes technologies moléculaires à haut débit ont été utilisées, plus spécifiquement l’analyse de l’ARN 16S et la métabolomique. Nous avons choisi de travailler sur l’ARN 16S directement car cette technique permet de cibler spécifiquement les microorganismes actifs qui sont encore peu souvent étudiés. La métabolomique permet l’étude des métabolites qui sont des molécules de faibles poids moléculaire, dont l’étude permet de déterminer les voies métabolique utilisées lors de la dégradation d’un substrat. Cette méthodologie est particulièrement récente en comparaison des autres méthodologies omiques et est encore peu utilisée dans le domaine de la digestion anaérobie. Pour extraire les informations essentielles et intégrer les différentes données obtenues, des méthodes spécifiques de biostatistiques ont été utilisées. Ces méthodes ont été choisies pour leur pertinence à répondre aux questions posées durant ce travail de thèse.Le premier objectif de ce travail de thèse a été d’étudier l’influence de la composition et de sa modification sur l’activité microbienne. Une des stratégies pour l’optimisation des performances des digesteurs et contrer de possibles inhibitions, est de réaliser la digestion commune de différents déchets. Le choix de la composition de l’alimentation influence grandement les performances de production. Cependant, peu d’informations existent concernant le lien entre l’activité microbienne et la dégradation des substrats constituant l’alimentation. Dans un premier temps l’influence de la composition de l’alimentation a été étudiée. Les digesteurs ont été alimentés avec différents mélanges de substrats. Les résultats montrent que la composition en substrat joue un rôle sur la diversité et la spécificité du microbiome. Ceci expliquerait les différences de performances de production de biogaz entre les réacteurs. Dans un deuxième temps, des corrélations entre la dégradation de différents substrats et l’activité microbienne ont été établies grâce à l’intégration des données de l’analyse de l’ARN 16S et métabolomique. Ce travail de thèse a permis d’établir de nouveaux potentiels dégradeurs de molécules spécifiques de différents substrats.Le second objectif de ce travail de thèse a été de déterminer l’influence de l’accumulation de l’azote ammoniacal sur l’activité microbienne. L’azote ammoniacal est un inhibiteur majeur de la digestion anaérobie et particulièrement de l’étape de méthanogénèse. Il peut être produit lors de la dégradation de substrats riches en protéines. Si certaines études ont permis d’identifier des microorganismes sensibles à l’azote ammoniacal, aucun consensus n’a pu être établi pour le moment. Dans ce travail une expérience a été réalisée en ajoutant de l’azote ammoniacal à différentes vitesses. Les résultats montrent qu’une accumulation rapide entraine des modifications importantes sur les performances des digesteurs. La capacité de résistance des microorganismes a été étudiée en réalisant une étude longitudinale de l’ARN 16S tout au long de l’expérience. Cette analyse a permis d’évaluer la capacité d’adaptation des microbes face à des conditions d’accumulation de l’azote ammoniacal différentes. De plus, des microorganismes spécifiquement341inhibés par l’accumulation de l’azote ammoniacal ont été identifiés et pourraient être utilisés comme de bio-indicateurs pour signaler une inhibition du digesteur. De la même façon, l’évolution temporelle des métabolites a été analysée.Le troisième et dernier objectif de ce travail de thèse a été de déterminer le mécanisme permettant à la zéolite de limiter l’inhibition par l’azote ammoniacal. La zéolite est un support minéral connue pour limiter les inhibitions pouvant avoir lieu durant le bioprocédé est dues à différents composés comme l’azote ammoniacal ou le phénol. Différentes hypothèses sur le rôle de la zéolite pour limiter l’inhibition ont été avancées : adsorption de l’azote, capacité d’échange d’ions ou le rôle de support pour la croissance microbienne. Cependant, les études décrivant l’influence de la zéolite sur l’activité microbienne et le lien avec les performances des digesteurs sont encore peu nombreuses. Dans ce travail, nous avons comparé l’influence de la zéolite sur les performances de production en présence d’une faible quantité d’azote ammoniacal. De façon générale, la zéolite n’influence pas la composition microbienne et les performances des digesteurs en absence d’azote ammoniacal, alors qu’un effet significatif a été observé en présence d’azote. Une analyse discriminante a permis de mettre en évidence l’impact de la zéolite sur la syntrophie microbienne nécessaire à la dégradation du propionate. Des données de la littérature ont été inclues à l’analyse afin d’évaluer la généricité des résultats.Les résultats de ces travaux de thèse mettent en évidence l’importance des paramètres opérationnels sur l’activité microbienne. Des analyses statistiques innovantes ont été proposées pour décrire plus en profondeur le microbiome. Par exemple, des phylotypes clés sensibles à des inhibitions spécifiques ont été identifiés. Certains pourraient être utilisés comme bio-indicateurs pour le suivi du fonctionnement des digesteurs. De plus, ce travail met en évidence la plus-value de la métabolomique dans le domaine des bioprocédés, puisqu’elle permet de suivre la dégradation de la matière organique et de déduire le rôle potentiel des microbes dans le procédé de dégradation.ronomique vétérinaire et forestier de France Spécialité : sciences de l'environnement École doctorale n°581 Agriculture, alimentation, biologie, environnement et santé (ABIES)