Structural and functional study of the respiratory syncytial virus nucleocapsid | Etude structurale et fonctionnelle de la nucléocapside du virus respiratoire syncytial

English. Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of bronchiolitis and pneumonia in young children. It is also responsible for severe respiratory infections in elderly or immunocompromised people. There is no vaccine or specific treatment for RSV.RSV is an enveloped virus with a single-stranded negative-sense RNA genome containing 10 genes coding for 11 proteins. The viral genome is constantly encapsidated by multiple copies of the viral nucleoprotein N, constituting a helical N-RNA complex, called the nucleocapsid. During the viral cycle, the nucleocapsid is used as a template by the viral polymerase L to (i) transcribe viral messenger RNAs, and (ii) replicate genomes and antigenomes. The activities of the polymerase L require interaction with its main cofactor, the phosphoprotein P, as well as the transcription anti-terminator protein M2-1. P can be seen as the hub of the virus multiplication, able to interact with the polymerase L, the nucleocapsid, M2-1, but also with the neosynthesised N, allowing its maintenance in a monomeric and RNA-free form, called N0. Viral transcription and replication steps take place in viral factories, in the cytoplasm of the infected cells. Viral factories are membrane-less organelles formed by liquid-liquid phase separation, whose morphogenesis depends on the expression of N and P. N, P, and their interactions, therefore, play a central role not only in the function of the polymerase L but also in the formation of viral factories. However, the mechanisms regulating the specificity of viral genomic and antigenomic RNA encapsidation, dependent on the N0-P to N-RNA transition, remain poorly characterised. Furthermore, high-resolution structural information is limited to the crystallographic structure of RSV N-RNA rings. In this context, my thesis work aimed at obtaining functional and structural data on the RSV nucleocapsid, following two main axes: (i) the study of the role of RNA in the encapsidation by N and (ii) the determination of the structure of the RSV nucleocapsid by cryo-electron microscopy. Starting from the ability to purify a recombinant monomeric and RNA-free N0 expressed in E. coli, I first studied the propensity of this protein to encapsidate different synthetic RNAs in vitro. The data obtained showed that encapsidation can be triggered in the presence of a 7 nucleotides-long RNA, but that 11 nucleotides are required to form stable N-RNA complexes in vitro. Secondly, the nature of the 5' end of the RNAs does not explain the specificity of encapsidation. Finally, we have shown that RNA encapsidation by the N protein is essential for the reconstitution of pseudo-viral factories in vitro. In parallel, the purification of nucleocapsids expressed in insect cells allowed us to determine the cryo-electron microscopy structures of several N-RNA assemblies (helical nucleocapsid, double-headed helical nucleocapsid, ring-capped helical nucleocapsid, and N-RNA double ring). Specifically, our data revealed that the RSV nucleocapsid exhibits a non-canonical symmetry, with an asymmetric unit composed of 16 N protomers. This particular assembly leads to a variation in the RNA accessibility along the helix. Finally, we have shown that this non-canonical symmetry depends on the C-terminal arm of the N protein since its truncation leads to the formation of a helical nucleocapsid of canonical symmetry.

French. Le virus respiratoire syncitial (VRS) est la première cause de bronchiolites et de pneumonies chez les jeunes enfants. Il est également responsable d'infections respiratoires sévères chez les personnes âgées ou immunodéprimées. Il n'existe pas de vaccin ni de traitement spécifique contre le VRS. Le VRS est un virus enveloppé dont le génome est un ARN simple-brin de polarité négative contenant 10 gènes codant pour 11 protéines virales. Le génome viral est constamment encapsidé par de multiples copies de la nucléoprotéine virale N, constituant un complexe N-ARN en forme d'hélice, appelé nucléocapside. Au cours du cycle viral, la nucléocapside est utilisée comme matrice par la polymérase virale L pour (i) transcrire les ARN messagers viraux, et (ii) répliquer génomes et antigénomes. Les activités de la polymérase L dépendent de ses cofacteurs viraux, la phosphoprotéine P et la protéine M2-1, anti-terminateur de la transcription. La protéine P peut être vue comme le chef d'orchestre de la multiplication du virus, capable d'interagir avec la polymérase L, la nucléocapside, la protéine M2-1, mais également avec la protéine N néosynthétisée, permettant ainsi son maintien sous forme monomérique et non liée à l'ARN, nommée N0. Les étapes de transcription et de réplication se déroulent au sein d'usines virales, dans le cytoplasme de la cellule infectée. Les usines virales sont des organelles dépourvues de membranes, formées par séparation de phase liquide, dont la morphogénèse dépend de l'expression des protéines N et P. Les protéines N et P et leurs interactions jouent par conséquent un rôle central non seulement pour le fonctionnement de la polymérase mais également dans la formation des usines virales. Toutefois, les mécanismes régulant la spécificité d'encapsidation des ARN génomique et antigénomique viraux, dépendant de la transition N0-P vers N-ARN, restent mal caractérisés. De plus, les informations structurales de haute résolution sont limitées à la structure cristallographique d'anneaux N-ARN du VRS. Dans ce contexte, mes travaux de thèse visaient à obtenir des données fonctionnelles et structurales sur la nucléocapside du VRS, suivant deux axes principaux : (i) l'étude du rôle de l'ARN dans l'encapsidation par la protéine N et (ii) la détermination de la structure de la nucléocapside du VRS par cryo-microscopie électronique. Partant de la capacité à purifier une protéine N recombinante exprimée chez E. coli sous forme monomérique et non liée à l'ARN, j'ai dans un premier temps étudié la capacité de cette protéine à encapsider différents ARN synthétiques in vitro. Les données obtenues ont permis de montrer que l'encapsidation peut se déclencher en présence d'ARNs de 7 nucléotides, mais que 11 nucléotides sont nécessaires pour former des complexes N-ARN stables in vitro. Cependant, la nature de l'extrémité 5' des ARNs ne permet pas d'expliquer la spécificité d'encapsidation. Enfin, ces travaux ont permis de montrer que l'encapsidation de l'ARN par la protéine N est indispensable pour la reconstitution de pseudo-usines virales in vitro. En parallèle, la purification de nucléocapsides exprimées en cellules d'insectes nous a permis de déterminer la structure par cryo-microscopie électronique de plusieurs assemblages N-ARN (nucléocapside hélicoïdale, nucléocapside hélicoïdale à deux têtes, nucléocapside hélicoïdale coiffée d'un anneau, et double-anneaux N-ARN). Plus spécifiquement, nos données ont permis de révéler que la nucléocapside du VRS présente une symétrie non-canonique, avec un assemblage en unité asymétrique composée de 16 protomères de N. Cet assemblage particulier conduit à une variation dans l'accessibilité de l'ARN le long de l'hélice. Enfin, nous avons montré que cette symétrie non-canonique dépendait du bras C-terminal de la protéine N, puisque son raccourcissement entraine la formation d'une nucléocapside hélicoïdale de symétrie canonique.