The secretome of bacteria from the Mycoplasma genus ˸focus on secreted peptidases and extracellular vesicles produced by mycoplasmas isolated in ruminants. | Le sécrétome des bactéries du genre Mycoplasma ˸ focus sur les protéases sécrétées et les vésicules extracellulaires produites chez les mycoplasmes des ruminants.

English. Bacteria belonging to the Mycoplasma (M.) genus are responsible for major diseases in ruminants, three of which are notifiable to the world organization for animal health. Despite this, their virulence factors are still poorly characterized. Molecules belonging to the mycoplasma secretome are potential candidates as virulence factors, as they are likely to interact with the host cells. The secretome includes compounds released in the extracellular compartment, also called the exosecretome, compounds exposed to the surface and the secretion machinery itself. The secretome has been poorly studied in mycoplasmas so far. Our research focused on the exosecretome and more specifically on secreted proteases and extracellular vesicles from Mycoplasma species commonly isolated in ruminant respiratory tract.A proteasic, caseinolytic activity was identified for several Mycoplasma species. For some of them, this activity was hypothesized to be present in the extracellular compartment as it was detected in the culture supernatant of after diffusion on milk agar plate. The use of a defined medium linked with mass spectrometry allowed us to observe that three pathogenic sub-species belonging to the Mycoides cluster were able to secrete active extracellular proteases. A mutant strain of M. capricolum subsp. capricolum California Kid for which the gene MCAP_0240 (encoding an S41 protease) was inactivated was used to confirm that the extracellular caseinolytic activity was abolished in the absence of the S41 protease. In the mutant strain, the secretion of 17 other proteins was also shown to be modified. Hence, the S41 protease could play a role in post traductional cleavage of surface proteins and, thus in secretion mechanisms. In a second phase, we studied another element of the exosecretome, the extracellular vesicles, which are produced by several Mycoplasma species in nutritional stress conditions. Analyses of membrane proteins of the vesicles highlighted several proteins known to be in interaction with the host cells, as described in the literature. M. mycoides subsp. mycoides, was subsequently chosen as a model sub species due to its high production of vesicles. It was used to show that vesicles release relies on cell viability and that vesicles are formed by a budding-type mechanisms as observed by electronic microscopy. In our experimental conditions, the vesicles were released in the decline growth phase. In consequence, we tried to identify which conditions of this growth phase were promoting the vesicles production. Several assays for optimizing vesicles purification were also tested in vitro, the ultimate goal being to be able to better characterize the whole extracellular vesicle proteins content by mass spectrometry. In conclusion, this work allowed us to detect secreted proteases and extracellular vesicles, carrying several membrane proteins, which could interact with the animal host. The role of these two elements as secretion systems and/or virulence factors has yet to be further studied.

French. Les bactéries du genre Mycoplasma (M.) sont responsables chez les ruminants de maladies majeures dont trois sont à déclaration obligatoire auprès de l’organisation mondiale de la santé animale. Malgré l’importance de ces bactéries, leurs facteurs de virulence restent mal caractérisés. Les molécules appartenant au sécrétome mycoplasmique sont des candidats privilégiés en tant que facteurs de virulence en raison de leur interaction potentielle avec les cellules de l’hôte. Le sécrétome regroupe les composés libérés dans le milieu extracellulaire, l’exosécrétome, et ceux présents à la surface membranaire, ainsi que la machinerie impliquée dans la sécrétion. Il a peu été étudié chez les mycoplasmes. Nos recherches se sont focalisées sur l’exosécrétome et, plus particulièrement, sur les protéases sécrétées et les vésicules extracellulaires pour des espèces de mycoplasmes couramment isolées chez les ruminants, notamment au niveau de la sphère respiratoire. Une activité protéasique de type caséinolytique a été mise en évidence chez plusieurs espèces. Pour certaines, cette activité pourrait être extracellulaire car détectée dans le surnageant de culture ou diffuse en milieu gélosé. L’emploi d’un milieu défini, couplé à la zymographie et à la spectrométrie de masse, nous a permis d’observer que trois sous-espèces appartenant au « groupe mycoides » et pathogènes sécrètent des protéases actives. L’étude d’un mutant de M. capricolum subsp. capricolum, California Kid dont le gène MCAP_0240 codant pour une protéase S41 a été inactivé, a confirmé que l’activité caséinolytique était portée par cette protéase. De plus, chez ce mutant la sécrétion dans le milieu extérieur de 17 protéines a été modifiée. Cette peptidase pourrait donc intervenir dans le clivage post traductionnel de protéines de surface et donc intervenir dans les mécanismes de sécrétion.Dans un second temps nous nous sommes intéressés à un autre élément de l’exosécrétome, les vésicules extracellulaires, produites par plusieurs espèces de mycoplasmes en condition de stress nutritionnel. L’étude du protéome membranaire des vésicules nous a permis de mettre en évidence de nombreuses protéines dont la capacité d’interaction avec l’hôte est décrite dans la littérature. Sur une sous-espèce modèle produisant de nombreuses vésicules, M. mycoides subsp. mycoides, nous avons montré que cette production résultait d’un phénomène actif nécessitant une viabilité cellulaire et avons observé par microscopie électronique la formation de vésicules par bourgeonnement. Dans nos conditions expérimentales, les vésicules extracellulaires sont produites en phase de déclin. Nous nous sommes donc intéressés plus particulièrement à cette phase et à ce qui pourrait favoriser la production de vésicules. Plusieurs conditions expérimentales visant à optimiser la purification des vésicules ont également été testées, l’objectif final étant de pouvoir soumettre les extraits vésiculaires à une analyse par spectrométrie de masse et ainsi caractériser l’ensemble des protéines présentes. En conclusion, ces travaux ont permis de détecter dans le milieu extracellulaire de cultures mycoplasmiques des protéases actives et des vésicules extracellulaires portant à leur membrane diverses protéines en interaction potentielle avec l’hôte animal. Le rôle de ces deux éléments comme systèmes de sécrétion et/ou facteurs de virulence potentiels devra faire l’objet de futures investigations.