Identification of new players in the plant DNA Damage Response. | Identification de nouveaux facteurs impliqués dans la réponse aux lésions de l'ADN chez Arabidopsis thaliana

English. Since plants are sessile organisms, they cannot avoid environmental stresses. In addition, endogenous stresses linked to cell function add to the above, leading to the formation of DNA damage. These damages are signalled by two main pathways: the ATM (ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED) pathway and the ATR (ATM and RAD3-RELATED) pathway. The ATM pathway is mobilised in the presence of double-strand breaks and the ATR pathway when the replication fork is slowed or arrested, causing replicative stress and leading to DNA damage when the problem is unresolved. The aim of my thesis was to understand how plants respond to replicative stress using the model plant Arabidopsis thaliana. We first showed that Pol θ is essential for the repair of damage linked to replicative stress. We then looked at the signalling pathways involved in replicative stress. Downstream of ATR, the SOG1 (SUPPRESSOR OF GAMMA RESPONSE 1) protein is considered to be the central integrator of the DNA damage response thanks to its ability to activate numerous DDR genes. However, the team had shown that SOG1 was not the only factor involved. We have shown that the E2FA and B proteins can bind to certain SOG1 targets at the same binding sites as SOG1. In addition, we have shown that E2FB acts in parallel with SOG1, and is capable of regulating DDR genes required to maintain the phenotype of plants undergoing replicative stress. We were thus able to show that E2Fs are important for the response to replicative stress and that they complement the role of SOG1. To go further and identify other factors involved in the response to replicative stress in plants, we carried out a genetic screen to find suppressors of the pol2a mutation that causes constitutive replicative stress. Among the selected candidates, we identified a mutation in the LUMINIDEPENDENS (LD) gene. Using phenotyping and cell biology experiments, we demonstrated that ld mutants are less sensitive to replicative stress and show partially restored growth and cell cycle. However, ldpol2a double mutants exhibit more DNA breaks than single mutants. This indicates that LD is involved in the replicative stress response. Chromatin immunoprecipitation and RNA sequencing experiments showed us that LD binds to numerous targets with varied motifs and has a global role in suppressing the accumulation of transcripts, particularly in the event of replicative stress. In fact, adding Drosophila spike-in in RNA-seq showed that ld and ldpol2a mutants accumulate more transcripts overall than Col0 and pol2a. In addition, we confirmed by mass spectrometry that LD has protein partners (SDG26 and FLD) known to form a complex with LD, conferring on them a histone demethylase role that could resolve conflicts linked to the convergent transcription of certain genes. We also observed that certain partners are involved in RNA metabolism. In the presence of replicative stress, LD is also associated with RPA proteins that bind to single-stranded DNA at replication forks. We therefore propose that LD could play a role in regulating transcription-transcription and replication-transcription collisions, even more so when the replication forks are blocked in the event of replicative stress. Preliminary analyses of FLD seem to indicate that it acts with LD in response to replicative stress, pointing to interesting prospects for analysis of conflicts between transcription and replication in plants.

French. Les plantes étant des organismes sessiles, elles ne peuvent se soustraire aux stress environnementaux. De plus, les stress endogènes liés au fonctionnement cellulaire s'ajoutent aux précédents, conduisant à la formation de dommages sur l'ADN. Ces dommages sont signalés grâce à deux voies principales, la voie ATM (ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED) et la voie ATR (ATM and RAD3-RELATED). La voie ATM est mobilisée en présence de cassures double brin, et la voie ATR lorsque la fourche de réplication est ralentie ou arrêtée, provoquant du stress réplicatif et conduisant à des lésions de l'ADN lorsque le problème n'est pas résolu. L'objectif de ma thèse était de comprendre comment les plantes répondent au stress réplicatif, en utilisant la plante modèle Arabidopsis thaliana. Nous avons tout d'abord montré que la Pol θ est essentielle pour la réparation des dommages liés au stress réplicatif. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de signalisation mises en jeu par le stress réplicatif. En aval d'ATR, la protéine SOG1 (SUPPRESSOR OF GAMMA RESPONSE 1) est considérée comme l'intégrateur central de la réponse aux dommages de l'ADN grâce à sa capacité d'activation de nombreux gènes de la DDR. Cependant, l'équipe avait montré que SOG1 n'était pas le seul facteur impliqué. Nous avons montré que les protéines E2FA et B sont capables de se lier à certaines cibles de SOG1, au niveau des mêmes sites de liaison que SOG1. De plus, nous avons montré que E2FB agit en parallèle de SOG1, et est capable de réguler des gènes de la DDR nécessaires au maintien du phénotype des plantes subissant un stress réplicatif. Ainsi, nous avons pu montrer que les E2Fs sont importants dans la réponse au stress réplicatif et qu'ils complémentent le rôle de SOG1. Pour aller plus loin et identifier d'autres facteurs impliqués dans la réponse au stress réplicatif chez les plantes, nous avons réalisé un crible génétique pour trouver des suppresseurs de la mutation pol2a qui provoque un stress réplicatif constitutif. Parmi les candidats sélectionnés, nous avons identifié une mutation sur le gène LUMINIDEPENDENS (LD). Grâce à des expériences de phénotypage et de biologie cellulaire, nous avons mis en évidence que les mutants ld sont moins sensibles au stress réplicatif et présentent une croissance et un cycle cellulaire partiellement restaurés. Cependant, les doubles mutants ldpol2a présentent plus de cassures de l'ADN que les simples mutants. Cela indique que LD est impliquée dans la réponse au stress réplicatif. Les expériences d'immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage des ARNs nous ont montré que LD se lie à de nombreuses cibles aux motifs variés et qu'elle a un rôle global dans la suppression de l'accumulation de transcrits, notamment en cas de stress réplicatif. En effet, l'ajout de spike-in de Drosophile dans les RNA-seq nous ont permis de montrer que les mutants ld et ldpol2a accumulent globalement plus de transcrits que Col0 et pol2a. De plus, nous avons confirmé par spectrométrie de masse que LD possède des partenaires protéiques (SDG26 et FLD) connus pour former un complexe avec LD, leur conférant un rôle d'histone déméthylase qui permettrait de résoudre les conflits liés à la transcription convergente de certains gènes. Nous avons aussi observé que certains partenaires sont impliqués dans le métabolisme des ARNs. En présence de stress réplicatif, LD est aussi associée aux protéines RPA qui se lient à l'ADN simple brin au niveau des fourches de réplication. Nous proposons donc que LD pourrait jouer un rôle dans la régulation des collisions transcription-transcription et réplication-transcription, d'autant plus important lorsque les fourches de réplication sont bloquées en cas de stress réplicatif. Les premières analyses conduites sur FLD semblent indiquer qu'elle agit avec LD pour répondre au stress réplicatif, et laisse entrevoir des perspectives intéressantes pour l'analyse des conflits entre transcription et réplication chez les plantes.