High resolution 3D imaging and reconstruction of whole zebrafish testis is a promising approach to investigate the number and the spatial organization of the adult spermatogonial stem cells | L'imagerie 3D à haute résolution et la reconstruction du testicule entier du poisson zèbre constituent une approche prometteuse pour étudier le nombre et l'organisation spatiale des cellules souches spermatogoniales adultes.

National audience

French. La dynamique cellulaire et les mécanismes moléculaires sous-jacents permettant le renouvellement du stock de cellules souches germinales dans les testicules adultes restent mal connus chez les poissons. En l'absence de marqueurs strictement spécifiques des cellules souches germinales adultes, l'identification et le dénombrement de ces dernières dans le testicule reposent principalement sur des analyses histologiques utilisant des critères morphologiques, ultra-structuraux et topologiques. Malgré l'utilisation de coupes sériées, il est très difficile de distinguer, sur des images 2D, les cellules souches germinales isolées des cellules formant des doublets de cellules spermatogoniales indifférenciées. De plus, une approche aussi laborieuse est généralement restreinte à des zones limitées du testicule qui peuvent ne pas refléter l'ensemble du tissu. L'imagerie tridimensionnelle (3D) à feuilles de lumière et à haute résolution d'organes entiers est une technique prometteuse qui pourrait contourner les inconvénients de l'approche histologique 2D. Dans la présente étude, nous avons amélioré une technique de clarification des tissus (CUBIC) pour imager avec un microscope à feuilles de lumière les testicules de poissons zèbres transgéniques adultes (Dr_gsdf:eGFP/vasa:DsRed) exprimant la protéine fluorescente rouge (Dsred) dans les sous-populations spermatogoniales (y compris les cellules souches germinales uniques) et la protéine fluorescente verte (GFP améliorée) dans les cellules de Sertoli. L’utilisation de lignées rapportrices de poissons zèbres a été préférée à d'autres techniques de marquage cellulaire pour assurer un marquage homogène des cellules ciblées sur toute la profondeur du tissu. La fluorescence endogène et le marquage de l'ADN nucléaire ont été préservés en profondeur permettant des enregistrements tous les 0,5 μm sur une profondeur de 700 µm. Les projections 3D des piles d'images ont montré que les cellules de Sertoli étaient présentes dans toutes les régions tapissant les parois tubulaires et délimitant différents cystes, tandis que les spermatogonies sont surtout organisées en chaines au bord de la paroi tubulaire ou en amas contenant 2 à 16 cellules. L’expression de DsRed et la taille nucléaire moyenne diminuent dans les spermatogonies des cystes à 16 cellules. A contrario, la compaction de la chromatine augmente dans ces cellules. L'imagerie 3D à haute résolution décrite dans la présente étude constitue une grande amélioration et un complément utile de nos approches histologiques antérieures. Pour compléter notre approche, nous recherchons des marqueurs moléculaires spermatogoniaux plus cellules-spécifiques par des approches de single cell RNA seq réalisés sur des gonades de zebrafish adultes présentant un enrichissement en spermatogonies indifférenciées dû à un arrêt puis une reprise de la spermatogénèse induite à la fin d’un traitement par l’œstradiol. Ce protocole expérimental nous a permis de mettre en évidence au moins 5 clusters de spermatogonies. L’utilisation de marqueurs discriminant ces clusters, couplée à la segmentation automatique d’objets d’intérêt sur les projections 3D, devraient faciliter et améliorer considérablement l'estimation des différentes sous-populations spermatogoniales, y compris les cellules souches spermatogoniales isolées.