Exploring the fine composition of Camelus milk from Kazakhstan with emphasis on protein components | Analyse de la composition fine du lait des Camelidés du Kazakhstan en ciblant plus spécifiquement la fraction protéique

English. The present study aimed to identify, in exploring the protein fraction of camelid milks from several regions of Kazakhstan, original molecules (peptide, proteins) potentially responsible for the properties attributed to camel milk. Nearly 180 milk samples from two camel species (Camelus bactrianus and C. dromedarius, and their hybrids) we collected at different lactation stage, age and calving number, and submitted to different proven analytical techniques and proteomic approaches (SDS-PAGE, LC-MS/MS and LC-ESI-MS). A detailed characterization of 50 protein molecules, relating to genetic variants, isoforms arising from post-translational modifications and alternative splicing events, belonging to 9 protein families (κ-, αs1-, αs2-, β-; and γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA/LPO) was achieved. We reported the occurrence of two unknown isoforms (i1 and i2) of camel αs2-CN arising from alternative splicing events. Using cDNA-sequencing, i1 was characterized as a splicing-in variant of an in-frame 27-nucleotide sequence, of which the presence at the genome level, flanked by canonic motifs defining an exon 13 encoding the nonapeptide ENSKKTVDM, was confirmed. Isoform i2, which appeared to be present at different phosphorylation levels ranging between 8P and 12P, was shown to include an additional decapeptide (VKAYQIIPNL), revealed by LC-MS/MS, encoded by a 3’-extension of exon 16. In addition, we reported, for the first time to our knowledge, the occurrence of a αs2-CN phosphorylation isoform with at least one phosphorylated S/T residue that does not match with the usual canonic sequence (S/T-X-A) recognized by the mammary kinase, suggesting thereby the existence of two kinase systems involved in the phosphorylation of caseins in the mammary gland.As far as camel WAP is concerned, we identified in C. bactrianus a new genetic variant (B), originating from a transition G => A, leading to a codon change (GTG/ATG) in the nucleotide sequence of cDNA, which modifies a single amino acid residue at position 12 of the mature protein (V12M). In addition, we describe the existence of a splicing variant of camel WAP, arising from an alternative usage of the canonical splice site recognized as such in the other mammalian species expressing WAP in their milk. We also report that the WAP isoform predominantly present in camelids milk, first described by Beg et al. (1986) as displaying an additional sequence of 4 amino acid residues (56VSSP59) in the peptide segment connecting the two 4-DSC domains, results from the usage of an unlikely intron cryptic splice site, extending camel exon 3 on its 5’ side by 12-nucleotides. In addition, we confirm that in the camel gene encoding WAP, intron 3 is a GC-AG intron, with a GC donor site showing a compensatory effect in terms of a dramatic increase in consensus at the acceptor exon position.Finally, using an optimized protocol, we isolated camel milk-derived EVs satisfiying the typical requirements for exosomal morphology, size and protein content. We identified a thousand of different proteins representing the first comprehensive proteome of camel milk-derived EVs that appears wider than camel milk proteome, including markers associated with small extracellular vesicles, such as CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 and ADAM10. We also identified proteins present in other milk components. This is particularly the case for lactadherin/MFG-E8, Ras-related proteins or CD9 that have been reported to occur in MFG. Our results strongly suggest that milk-derived exosomes have different cellular origin.

French. La présente étude visait à identifier, en explorant la fraction protéique des laits de camélidés provenant de plusieurs régions du Kazakhstan, des molécules originales (peptides, protéines) potentiellement responsables des propriétés attribuées au lait de chamelle. Près de 180 échantillons de lait de 2 espèces de camélidés (Camelus bactrianus, C. dromedarius et leurs hybrides) ont été collectés à différents stades de lactation, âge et nombre de vêlages, et soumis à différentes techniques analytiques et approches protéomiques (SDS-PAGE, LC-MS/MS et LC-ESI-MS). Cinquante molécules protéiques correspondant à des variants génétiques, des isoformes issues de modifications post-traductionnelles et d'épissages différentiels, appartenant à 9 familles de protéines (κ-, αs1-, αs2-, β- et γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA / LPO) ont été caractérisées. L’existence de deux isoformes inconnues (i1 et i2) de la caséine αs2 a été observée dans les deux esèces. Ces isoformes sont des variants d'épissage consécutif pour l’un à l’intégration d'une séquence de 27 nucléotides « in frame », codant pour le nonapeptide ENSKKTVDM, dont la présence a été confirmée au niveau génomique, flanquée de motifs canoniques définissant une structure exonique. La seconde isoforme, présente à différents niveaux de phosphorylation compris entre 8P et 12P, comporte un décapeptide supplémentaire (VKAYQIIPNL), révélé par LC-MS/MS, codé par une extension 3 'de l'exon 16. En outre, nous rapportons, pour la première fois à notre connaissance, l’existence d'une isoforme de phosphorylation de la caséine αs2 présentant au moins un résidu S/T phosphorylé n’appartenant pas à la séquence canonique habituelle (S/T-X-A) reconnue par la kinase mammaire, suggérant ainsi l'existence de deux systèmes impliqués dans la phosphorylation des caséines, dans la glande mammaire.S’agissant de la WAP, nous avons identifié chez C. bactrianus un nouveau variant génétique (B), issue d'une transition G => A conduisant à un changement de codon (GTG/ATG) dans la séquence nucléotidique de l’ARNm, qui entraine un changement d’acide aminé en position 12 de la protéine mature (V12M). Un variant résultant de l’usage du site d'épissage canonique, reconnu comme tel chez les autres mammifères exprimant la WAP dans leur lait, a été identifié. La forme majoritaire de la WAP cameline, décrite pour la première fois par Beg et al. (1986) qui présente une insertion de 4 résidus d'acides aminés (56VSSP59) dans le segment peptidique reliant les deux domaines 4-DSC, résulte de l'utilisation d'un site d'épissage cryptique intronique improbable, prolongeant l'exon 3 du gène de 12 nucléotides sur son extrémité 5 '. De plus, nous confirmons que chez les camélidés, l'intron 3 du gène spécifiant la WAP, est un intron rare de type GC-AG, avec un site donneur faible qui s’accompagne d’un effet compensatoire au site consensus de l'exon accepteur.Finalement, en utilisant un protocole optimisé, nous avons isolé les vésicules extracellulaires (VE) dérivés du lait de camélidés présentant les caractéristiques morphologiques, de taille et de contenu en protéines des exosomes. Nous avons identifié un millier de protéines différentes représentant le premier protéome des VE dérivés du lait de chamelle qui semble plus étendu que le protéome du lait de chamelle, incluant notamment les marqueurs associés aux VEs, tels CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 et ADAM10. Nous avons également identifié des protéines présentes dans d'autres compartiments du lait. C'est notamment le cas pour les protéines apparentées à Ras, MFG-E8, ou CD9 qui sont également présentes dans les globules gras du lait. Nos résultats suggèrent par ailleurs fortement que les VEs dérivés du lait de chamelle ont des origines cellulaires différentes.