Déplétion et immobilisation sur différents gels acrylamide des protéines plasmatiques : évaluation des différents workflow testés par LC-MS/MS

DEUG

French. L’étude des protéines du plasma est très importante dans de nombreux domaines comme la médecine. Cela reste encore un challenge aujourd’hui alors que pourtant, les outils d’investigation n’ont jamais été aussi performants. En protéomique, par exemple, les systèmes LC-MS/MS sont capables de détecter des quantités infimes de peptides* (attomoles*). Néanmoins, la matrice plasmatique est « compliquée » à étudier car l’albumine et une quinzaine d’autres protéines représentent plus de 95% de la quantité totale des protéines, alors qu’en nombre, elles forment seulement 0.5% de l’ensemble des protéines présentes dans le plasma. Des solutions de déplétions* spécifiques (anticorps*) ou non spécifiques (ligands* aléatoires) existent mais elles ont un coût biologique et économique. Dans ce projet, nous avons souhaité tester ces méthodes de déplétion sur du plasma* humain et les comparer à une nouvelle méthode par excision des protéines majoritaires après séparation sur gel d’acrylamide. Pour ce faire, le gel d’acrylamide est réticulé* par un nouveau constituant, le N,N’-bis(acryloyl)cystamine, qui possède des ponts disulfures* pouvant être alkylés*. Cela confère au gel la capacité de se dissoudre et de libérer les protéines entières en solution. Les résultats obtenus dans cette étude montrent que les méthodes de déplétion sont très efficaces pour obtenir un mélange déplété de protéines plasmatiques, débarrassées à plus de 90% des protéines majoritaires. Néanmoins, l’identification et la quantification label free des protéines n’ont pas permis de conclure sur l’avantage de la déplétion sur le nombre de protéines supplémentaires étudiables grâce à ces méthodes. De plus, l’objectif de pouvoir tester, comme preuve de concept, le WorkFlow* déplétion par excision et dissolution du gel, grâce au nouveau réticulant, n’a pas été possible fautede pouvoir maitriser, au cours du stage, l’étape de dissolution. L’utilisation de ce gel BAC-DROP en WorkFlow classique a montré des résultats proches du gel SDS-PAGE mais sans réel avantage en termes d’hydrolyse* des protéines dans le gel ou d’extraction des peptides du gel après hydrolyse.