Contribution of the interaction between environment and genotype to flavour and aroma profile in non-traditional yeast | Contribution des interactions entre l'environnement et le génotype à la production d'arômes par des levures non-traditionnelles

English. Yeast is used for fermentation in the biotechnology sector and plays a critical role in the production of fermented beverages. The quality of the final product depends on yeast performance and the environmental conditions of fermentation. Combining knowledge on yeast biology and the different fermentation elements allows generation of beverages with new properties and improved processes. Nitrogen is an essential nutrient for yeast, nonetheless, besides the contribution of the nitrogen source to growth, some nitrogen compounds are precursors of volatile molecules that produce aroma. The nitrogen compounds assimilated by yeast are classified as rich or poor nitrogen sources depending on how they support growth. Although Saccharomyces cerevisiae is the most important and most widely used yeast species, other non-traditional yeasts are attracting industrial interest because of the new traits of technological interest that they offer. Saccharomyces uvarum has relevant properties that can be exploited for the production of fermented beverages. Particularly, the cryotolerance and capacity to produce high amounts of volatile compounds offers new opportunities for the fermentation industry. Kluyveromyces marxianus is another food-grade yeast that is of interest for its aroma properties. In S. cerevisiae, nitrogen metabolism is well-understood but less is known about these pathways in non-traditional yeasts, nor whether there are regulatory differences between the yeasts. This thesis explores nitrogen metabolism in non-traditional yeasts and the nitrogen source effect on the metabolome and transcriptome. The main focus was on S. uvarum as this is already used to a certain extent in the fermented beverage sector. First, we established the nitrogen preference of S. uvarum and subsequently performed fermentations with a reference S. uvarum strain in oenological conditions varying the nitrogen source to evaluate the fermentation performance and metabolome. Next, a comparative analysis of gene expression (RNAseq) in ammonium, methionine, phenylalanine and asparagine was performed to2determine how the nitrogen source affects the expression of key genes involved in nitrogen metabolism and aroma production in this species. In overall terms, the pathways used by S. uvarum were equivalent to those used by S. cerevisiae but some detail varied. One such detail was a major difference between S. cerevisiae and S. uvarum in use of asparagine, which we found was a preferred amino acid for S. cerevisiae but not for S. uvarum. This was intriguing, in particular because asparagine is the major source of nitrogen in apple juice, where S. uvarum is traditionally used for cider fermentation. This led us to explore the evolution history and functional role of ASP3, a gene involved in asparagine assimilation. Our data on the use of amino acids by S. uvarum highlighted the role of the Ehrlich pathway in interconversion of nitrogen compounds and in generation of precursors of aroma volatiles. As a complement to this work in S. uvarum, we expanded the study of amino acid metabolism to K. marxianus, specifically focusing on expression of the BAT1 gene encoding a branched chain aminotransferase responsible for both synthesis and catabolism of branched chain amino acids. The intriguing aspect of this was that while Saccharomyces spp. possess separate genes for the mitochondrial and cytosolic forms of the enzyme, Kluyveromyces spp. have a single gene that can be used to produce alternative proteoforms for the same purpose. In addition to uncovering a novel mechanism of transcriptional regulation in K. marxianus, the work also provided information to help explain the evolutionary basis for the retention of two copies of the gene in Saccharomyces spp. Overall, the research reported in this thesis demonstrates that exploring the metabolism and characteristics of non-conventional yeasts opens up possibilities to find interesting traits with potential industrial applications. This study increases understanding of the importance of the nitrogen source in fermentation performance and the flavour and aroma production of yeast and broadens the knowledge on S. uvarum, in particular, for applications in the fermented beverage industry.

French. La levure est utilisée pour la fermentation dans le secteur de la biotechnologie et joue un rôle essentiel dans la production de boissons fermentées. La qualité du produit final dépend des performances de la levure et des conditions environnementales de la fermentation. La combinaison des connaissances sur la biologie de la levure et les différents éléments de la fermentation permet de générer des boissons avec de nouvelles propriétés et des procédés améliorés. L'azote est un nutriment essentiel pour la levure ; néanmoins, outre la contribution de la source d'azote à la croissance, certains composés azotés sont des précurseurs de molécules volatiles qui produisent des arômes. Les composés azotés assimilés par la levure sont classés comme sources d'azote riches ou pauvres selon la façon dont ils soutiennent la croissance. Bien que Saccharomyces cerevisiae soit l'espèce de levure la plus importante et la plus largement utilisée, d'autres levures non traditionnelles suscitent un intérêt industriel en raison des nouveaux caractères d'intérêt technologique qu'elles offrent. Saccharomyces uvarum possède des propriétés pertinentes qui peuvent être exploitées pour la production de boissons fermentées. En particulier, la cryotolérance et la capacité à produire de grandes quantités de composés volatils offrent de nouvelles opportunités pour l'industrie de la fermentation. Kluyveromyces marxianus est une autre levure de qualité alimentaire qui présente un intérêt pour ses propriétés aromatiques. Chez S. cerevisiae, le métabolisme de l'azote est bien compris, mais on connaît moins ces voies chez les levures non traditionnelles, et on ignore s'il existe des différences de régulation entre les levures. Cette thèse explore le métabolisme de l'azote chez les levures non traditionnelles et l'effet de la source d'azote sur le métabolome et le transcriptome. L'accent a été mis sur S. uvarum, car elle est déjà utilisée dans une certaine mesure dans le secteur des boissons fermentées. Tout d'abord, nous avons établi la préférence de S. uvarum pour l'azote, puis nous avons réalisé des fermentations avec une souche de référence de S. uvarum dans des conditions œnologiques en faisant varier la source d'azote afin d'évaluer les performances de fermentation et le métabolome. Ensuite, une analyse comparative de l'expression des gènes (RNAseq) dans l'ammonium, la méthionine, la phénylalanine et l'asparagine a été réalisée pour déterminer comment la source d'azote affecte l'expression des gènes clés impliqués dans le métabolisme de l'azote et la production d'arômes chez cette espèce. Globalement, les voies utilisées par S. uvarum étaient équivalentes à celles utilisées par S. cerevisiae, mais certains détails variaient. Un de ces détails était une différence majeure entre S. cerevisiae et S. uvarum dans l'utilisation de l'asparagine, qui, nous l'avons constaté, était un acide aminé préféré pour S. cerevisiae mais pas pour S. uvarum. Ceci était intrigant, en particulier parce que l'asparagine est la principale source d'azote dans le jus de pomme, où S. uvarum est traditionnellement utilisée pour la fermentation du cidre. Cela nous a amenés à explorer l'histoire de l'évolution et le rôle fonctionnel de ASP3, un gène impliqué dans l'assimilation de l'asparagine. Nos données sur l'utilisation des acides aminés par S. uvarum ont mis en évidence le rôle de la voie d'Ehrlich dans l'interconversion des composés azotés et dans la génération de précurseurs de composés volatils d'arôme. En complément de ce travail sur S. uvarum, nous avons étendu l'étude du métabolisme des acides aminés à K. marxianus, en nous concentrant spécifiquement sur l'expression du gène BAT1 codant une aminotransférase à chaîne ramifiée responsable à la fois de la synthèse et du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée. L'aspect intrigant de ceci était que, tandis que Saccharomyces spp. possèdent des gènes distincts pour les formes mitochondriale et cytosolique de l'enzyme, Kluyveromyces spp. ont un seul gène qui peut être utilisé pour produire des protéiformes alternatives dans le même but. En plus de découvrir un nouveau mécanisme de régulation transcriptionnelle chez K. marxianus, le travail a également fourni des informations pour aider à expliquer la base évolutive de la rétention de deux copies du gène chez Saccharomyces spp. Dans l'ensemble, la recherche rapportée dans cette thèse démontre que l'exploration du métabolisme et des caractéristiques des levures non conventionnelles ouvre des possibilités de trouver des traits intéressants avec des applications industrielles potentielles. Cette étude accroît la compréhension de l'importance de la source d'azote dans les performances de fermentation et la production d'arômes et de saveurs de la levure et élargit les connaissances sur S. uvarum, en particulier, pour les applications dans l'industrie des boissons fermentées.