Development of a novel experimental platform for the study of Cytokinin perception and signalling pathway | Développement d'une nouvelle plateforme expérimentale pour l'étude de la perception et de la signalisation des cytokinines

English. Cytokinin (CK) hormones are one of the main plant morphogenetic signals. CK signallinginvolves a phospho-transfer, triggered by the binding to histidine kinase receptors. Thephosphate is transferred to histidine phosphotransferase proteins (AHP), and then from AHPsto response regulators (RRs), transcription factors that will activate target genes. Thispathway is non-linear as it is regulated by multiple negative feedbacks. The currentknowledge about this pathway results mostly from qualitative analysis of loss-of-functionmutants, and of transient expression assays in isolated plant cells (protoplasts), or inhomologous systems, such as bacteria and yeast. Here, we designed and built a platform freefrom the multiple regulatory interactions with other pathways occurring in planta, byreconstructing the full Arabidopsis thaliana CK signalling pathway in mammalian cells. Thisplatform allowed us to quantitatively characterize functional CK signalling regulators. Wenotably investigated the receptor selectivity to different CKs but also explored the mode ofaction of three RRs acting as repressors, and of AHPs, allowing to identify novel roles forthese proteins. We also assayed quantitatively the interaction between signalling effectors,allowing us to explore the role of a conserved RR residues in the interaction, and the effect ofthe formation of different complex on the CK pathway activity. Our results were furthervalidated in protoplasts, demonstrating the predictive power of our synthetic biology platformfor exploration of plant signalling pathways.

French. Les hormones cytokinines (CK) sont l'un des principaux signaux impliqués dans lamorphogénèse des plantes. La signalisation des CK implique un transfert de phosphate,déclenché par la liaison des CK à des récepteurs histidine kinase. Le phosphate est2ensuite transféré à des protéines histidine phosphotransférase (AHP), puis des AHP auxrégulateurs de réponse (RR), des facteurs de transcription qui vont activer les gènescibles des CK. Cette voie est non linéaire car elle est régulée par de multiplesrétroactions négatives. Actuellement, les connaissances sur cette voie proviennentprincipalement de l'analyse qualitative de mutants et de tests d'expression transitoiredans des cellules végétales isolées (protoplastes) ou dans des systèmes hétérologues,comme les bactéries et les levures. En reconstruisant la voie de signalisation CKcomplète d'Arabidopsis thaliana dans des cellules de mammifères, nous avons mis enplace une plateforme d’analyse de cette voie de signalisation exempte des multiplesinteractions avec d'autres voies de signalisation se produisant in planta. Cetteplateforme nous a permis de caractériser quantitativement les différents acteurs de lasignalisation de la CK. Nous avons étudié la sélectivité des récepteurs à différentes CKs.Nous avons aussi exploré le mode d'action de trois RRs agissant comme répresseurs, etdes AHPs, permettant d'identifier de nouvelles fonctions pour ces protéines. Nous avonségalement quantifié l'interaction entre les différents effecteurs de la signalisation,permettant d'explorer le rôle de résidus conservés des RR dans ces interactions, ainsique l'effet de la formation de différents complexes sur l'activité de la voie designalisation des CK. Nos résultats ont été validés dans des protoplastes, démontrant lepouvoir prédictif de cette plateforme de biologie synthétique pour l'exploration desvoies de signalisation des plantes.