[Mycobacterium DNA extraction from clinical samples] | Extraccion de ADN de micobacterias a partir de muestras clinicas

Spanish; Castilian. El objetivo fue determinar el mejor metodo de extraccion de ADN de micobacterias a partir de cultivos y muestras clinicas. Para la realizacion del trabajo se obtuvieron muestras de cultivos de Escherichia coli, Mycobacterium bovis (cepa BCG) y M. phlei; Tambien se utilizaron muestras de sangre, leche, exudado nasal y nodulos linfaticos de bovino, adicionadas con cantidades conocidas de M. phlei. Los cultivos se cuantificaron por medio de densidad optica y se utilizo 1 ml de cultivo con 6.6 X 10*8 bacterias. Se emplearon 100 micro l de globulos blancos obtenidos a partir de sangre completa con anticoagulante. Con respecto a la leche se emplearon 15ml, los cuales se centrifugaron a 5000 rpm y el sedimento se utilizo para la extraccion del ADN. El exudado nasal se colecto en un hisopo, el cual fue colocado en 10 ml de solucion amortiguadora de fosfatos; 12 horas despues el hisopo se retiro y el liquido se centrifugo a 5000 rpm, el sedimento se empleo para la extraccion. Para lisar las celulas de los cultivos, la leche, la sangre y el hisopo nasal se utilizaron los siguientes tratamientos: 1.- pepsina al 0.2 con incubacion de 1 hora a 58C, 2.- congelacion con nitrogeno liquido y Triton X100 al 2, 3.- ebullicion y Triton X100 al 0.45, 4.- ebullicion con Tween 20 al 0.45, 5.- lisozima (lmg/ml), proteinasa K (100 micro g/ml) y SDS al 4. La muestra de tejido (10g) se macero con nitrogeno liquido o por medio de un homogenizador Virtis y las celulas se lisaron con los siguientes tratamientos: 1.- proteinasa K (100 micro g/ml) coii SDS al 1 y 2.- pepsina acida al I. Posteriormente se extrajo el ADN con fenol-cloroformo y se precipito con etanol absoluto. Los resultados mostraron que la mejor extraccion de ADN a partir de cultivo (M. bovis, M. phlei y E. coli), leche, sangre y exudado nasal se logro con el metodo de lisozima-proteinas K-SDS, mientras que en el caso de tejido los mejores resultados se obtuvieron con Proteinasa K- SDS, sin embargo la maceracion previa del tejido con nitrogeno liquido representa un problema de contaminacion. Se concluyo que puede obtenerse DNA de micobacterias a partir de las muestras clinicas lisando las celulas con enzimas y un detergente, seguido de una extraccion fenolica.