Site-directed mutagenesis of a lytic polysaccharide monooxygenase from Micromonospora aurantiaca

English. Cellulose and chitin are the two most abundant biopolymers in nature and they are valuable biomaterials that supplements fossil resources in the production of fuels, materials and chemicals. Due to the recalcitrant nature of these polysaccharides, efficient conversion into soluble sugars is of major importance for a sustainable bio-economy in the future. Traditionally, enzymatic degradation of cellulose and chitin were thought to rely on the synergistic action of hydrolytic enzymes, but the recent discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) shows that these oxidative enzymes are important contributors to the depolymerization process. Cellulose-active AA10 LPMOs cleaves glycosidic bonds in the cellulose backbone by either specific C1 or C1/C4 oxidation. This oxidative regioselectivity is thought to be a result of different positioning of the LPMO on the cellulose, but the mechanisms behind the differences in regioselectivity is unknown. Understanding the mechanism of oxidative regioselectivity in LPMOs is important for both fundamental and applied reasons where optimization of enzyme cocktails is a major issue for biorefining of biomass.This study identifies a pair of amino acids in the sequence of LPMO10B from the bacterium Micromonospora aurantiaca that are likely to play an important role in the specificity of the protein’s oxidative regioselectivity. Highly conserved positions in the sequences of specific C1 oxidizing cellulose-active AA10 proteins were targeted for site-directed mutagenesis, and the C4 oxidizing activity of a MaLPMO10B variant, carrying two mutated residues, was almost completely lost. The finding suggests that both residues are highly important for the LPMO to carry out C4 oxidizing activity on cellulosic substrates.Characterization of two M. aurantiaca LPMOs were conducted: MaLPMO10B and MaLPMO10D. Both contain a CBM2 domain and are active on both cellulose (C1/C4 oxidizers) and chitin. The structure of MaLPMO10B was determined by X-ray crystallography to 1.08 Å. Structural comparison to other C1/C4 oxidizing cellulose-active AA10 proteins revealed a prolonged loop, comprising eight additional residues, near the substrate-binding surface of MaLPMO10B. From the research that has been conducted, it is possible to conclude that residues W82 and N85 play an important role in the determination of oxidative regioselectivity in MaLPMO10B. Further research will be necessary to identify additional residues to possibly eliminate the C4 oxidizing activity of the enzyme completely.

German. Cellulose og kitin er de to mest forekommende biopolymerene i naturen, og de er verdifulle biomaterialer som supplerer fossile ressurser i produksjonen av drivstoff, materialer og kjemikaler. Effektiv konvertering av disse vanskelig nedbrytbare polysakkaridene til løselige sukkerarter er av stor viktighet for en fremtidig bærekraftig bioøkonomi. Det tradisjonelle synet på enzymatisk nedbryting av cellulose og kitin har innebåret synergistisk handling mellom hydrolytiske enzymer, men den nylige oppdagelsen av lytiske polysakkaridmonooksygenaser (LPMOer) viser at disse oksidative enzymene er viktige bidragsytere til depolymeriseringsprosessen. Cellulose-aktive AA10 LPMOer kløyver glykosidiske bånd i cellulose-kjedene ved å enten oksidere kun C1-karbonet eller både C1 og C4 karbonet. Denne oksidative regioselektiviteten mistenkes å være et resultat av ulik posisjonering av LPMOen på cellulose kjeden, men mekanismene bak dette er ukjent. Å forstå mekanismen bak oksidativ regioselektivitet i LPMOer er viktig for både fundamentale og anvendte årsaker der optimalisering av enzym-cocktails er av stor viktighet for bioraffinering av biomasse. Denne studien identifiserer et par aminosyrer i sekvensen til LPMO10B fra bakterien Micromonospora aurantiaca som er antatt å spille en viktig rolle i spesifiseringen av proteinets oksidative regioselektivitet. Høyt konserverte posisjoner i sekvensen til spesifikt C1-oksiderende cellulose-aktive AA10 proteiner var målrettet for seterettet mutagenese, og den C4-oksiderende aktiviteten til en MaLPMO10B-variant, som inneholdt to muterte residuer, var nesten helt fjernet. Dette funnet antyder at begge residuene er meget viktige for at LPMOen kan utføre C4-oksiderende aktivitet på cellulose-substrater. Karakterisering av to LPMOer fra M. aurantiaca ble utført: MaLPMO10B og MaLPMO10D. Begge inneholdt et CBM2-domene, og begge var aktive på både cellulose (C1/C4-oksiderende) og kitin. Strukturen til MaLPMO10B ble bestemt ved røntgen krystallografi til 1.08 Å. Strukturell sammenlikning med andre C1/C4-oksiderende cellulose-aktive AA10 proteiner avslører av MaLPMO10B inneholder en forlenget loop, bestående av åtte ekstra residuer, nær den substratbindende overflaten. Fra forskningen som har blitt utført i denne studien kan det trolig konkluderes at residuene W82 og N85 spiller en viktig rolle i bestemmelsen av oksidativ regioselektivitet hos MaLPMO10B. Videre forskning vil være nødvendig for å identifisere ytterligere residuer for å muligens eliminere den C4-oksiderende aktiviteten til enzymet fullstendig.

M-BIOTEK