Discovery and characterization of cellulose-active lytic polysaccharide monooxygenases | Upptäckt och karaktärisering av cellulosa-aktiva lytiska polysackarid monooxygenaser

Effektiv enzymatisk depolymerisation av lignocellulosisk biomassa till fermenterbara sockerarter är ett viktigt steg i övergången till en mer miljövänlig och hållbar bioekonomi. Komplexiteten och resistensen av substratet begränsar dock enzym sammansättningarna som finns tillgängliga idag, vilket leder till att dessa preparat utgör en av de största kostnaderna vid produktion av biomassa-baserade kemikalier och bränslen. De nyligen upptäckta lytiska polysackarid-monooxygenaserna (LPMO-enzymer) har förändrat vår generella bild av polysackaridnedbrytning då dessa enzymer ökar aktiviteten till glykosidhydrolaser. LPMO-enzymer har till följd av detta gett höga förväntningar för vidare utveckling av enzym-verktyg för behandling av biomassa. LPMO-enzymer är koppar-beroende enzymer som i närvaro av syrgas och en extern elektrondonator oxiderar svårnedbrytbara polysackarider såsom kitin och cellulosa. Innan upptäckten av dess enzymatiska funktion, år 2010, var LPMO-enzymer klassificerade som familj 33 kolhydratsbindande moduler (numera familj 10 av auxiliär-aktiviteter, AA10, LPMO10) eller familj 61 av glykosidhydrolaser (numera AA9, LPMO9). Innan studierna som presenteras här påbörjades hade katalytisk aktivitet precis visats för en kitin-aktiv bakteriell LPMO10, kallad CBP21, från Serratia marcescens. Denna upptäckt lade grunden till det första målet för denna studie, nämligen att hitta eller konstruera en LPMO aktiv på cellulosa-substrat. Artikel I beskriver CelS2, en naturligt förekommande LPMO10 från den Gram-positiva bakterien Streptomyces coelicolor. Detta enzym klyver kristallinsk cellulosa och producerar C1-oxiderade cello-oligosackarider som i lösning ses i form av aldonsyror. Genereringen av oxiderade produkter demonstrerades med både masspektrometri och kromatografiska metoder. CelS2 består av en N-terminal AA10 och en C-terminal cellulosa-bindande kolhydrats-bindande modul, klassificerad som en CBM2, och representerar den första beskrivna LPMO som är aktiv på cellulosa. Det visades även att CelS2 stimulerade Celluclast® (ett kommersiellt enzym preparat) vid frigörandet av lösliga socker från hydrolys av filterpapper. Artikel II och III beskriver struktur-funktionsstudier av cellulosa-aktiva LPMO10- enzymer med syfte att ta reda på grundläggande egenskaper tillhörande dessa proteiner, samt att om möjligt identifiera faktorer som påverkar substratspecificitet och regioselektiv hydroxylering (d.v.s. C1- kontra C4-oxidation). Artikel II beskriver en jämförande studie av fyra C1-oxiderande LPMO10-enzymer, varav två är aktiva på kitin och två är aktiva på cellulosa. Aktiviteten hos två av dessa har tidigare inte dokumenterats, en visade aktivitet på kitin (BlLPMO10A från Bacillus licheniformis) och en på cellulosa (E8 från Thermobifida fusca). Sekvensanalys visade att alla aminosyror i den direkt kopparkoordinerande sfären är konserverade i de fyra LPMO10-enzymerna, men elektronparamagnetisk resonans (EPR) spektroskopi indikerade att den elektroniska miljön kring kopparatomen skiljde sig mellan kitin-aktiva och cellulosa-aktiva LPMO-enzymer. Det är därför troligt att skillnaden i EPR-spektra mellan kitin-aktiva och cellulosa-aktiva LPMO-enzymer reflekterar variation i aminosyror utanför den direkt koppar-koordinerande sfären. I Artikel III presenteras de första kristallstrukturerna på cellulosa-aktiva LPMO10- enzymer, vilket för fösta gången gjorde det möjligt att utföra en strukturell jämförelse av LPMO-enzymer med olika substratspecificiteter. De två S. coelicolor LPMO-enzymerna vars struktur bestämdes, CelS2 och ScLPMO10B, utgör ett konserverat par av LPMO10- enzymer som förekommer i cellulolytiska aktinomyceter. De två enzymerna är uppreglerade under bakteriell tillväxt på cellulosa och i denna studie visar vi att detta par agerar synergistiskt vid nedbrytning av cellulosa. CelS2 visar strikt C1-oxidation av cellulosa-substrat medan ScLPMO10B katalyserar oxidation på både C1- och C4-kolet i cellulosa samt C1-oxidation av β-kitin. En strukturell jämförelse av de två cellulosa-aktiva LPMO10-enzymerna avslöjade en skillnad i koppar-koordinationssfären som kan förklara (o)förmågan att oxidera C4-kolet. Strukturella jämförelser av kitin-aktiva och cellulosaaktiva LPMO10-enzymer visade en potentiell bindningsficka för en C2 acetamido-grupp i kitin-aktiva LPMO10-enzymer. Alla LPMO10-enzymer har likvärdiga redox-potentialer och bindningsaffiniteter för koppar, men visar en substrat-beroende skillnad i EPR-spektra som diskuterat i Artikel II. Till följd av detta verkar substratspecificitet vara beroende av variation i substrat-bindning och -positionering samt dessa i kombination med variation i den elektroniska strukturen för kopparsätet. Sammantaget utgör denna studie upptäckten av det första cellulosa-aktiva LPMOenzymet tillhörande familj 10 av auxiliär-aktiviteter, samt det första djupgående karaktäriseringsarbetet kring dessa typer av enzymer. Det föreliggande arbetet har på så sätt bidragit till grundläggande kännedom om dessa enzymer, samt till metodutveckling och utgör därmed en viktig bas för framtida LPMO-forskning.

English. The efficient depolymerization of lignocellulosic biomass to fermentable sugars by enzymatic hydrolysis is a key step in the transition towards a more environmentally friendly and sustainable bio-economy. However, the complexity and recalcitrant nature of the substrate limit enzyme performance on lignocellulosic plant biomass, and at present the enzyme cocktails required for depolymerization represent a major cost in the production of biomass-based chemicals and fuels. The recent discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) has changed our general understanding of polysaccharide deconstruction, and given rise to high expectations for further development of enzyme tools for biomass processing, since LPMOs enhance the activity of glycoside hydrolases.LPMOs are copper-dependent enzymes that oxidize recalcitrant polysaccharides such as chitin and cellulose in the presence of dioxygen, and an external electron donor. Before the discovery of their enzymatic function, in 2010, LPMOs were classified as either family 33 of carbohydrate-binding modules (now family 10 of auxiliary activities, AA10, LPMO10) or family 61 of glycoside hydrolases (now AA9, LPMO9). Prior to the studies presented here, catalytic activity had just been demonstrated for a chitin-active bacterial AA10-type of LPMO from Serratia marcescens called CBP21. The work on CBP21 formed the basis for the first goal of this study, namely finding or engineering an LPMO targeting cellulose substrates. Paper I describes CelS2, a naturally occurring AA10-type LPMO from the Gram-positive bacterium Streptomyces coelicolor that cleaves crystalline cellulose and produces C1-oxidized cello-oligosaccharides appearing in solution as aldonic acids. The generation of oxidized products was demonstrated using both mass spectrometry and chromatographic methods. CelS2, which comprises an N-terminal AA10 and a Cterminal cellulose-binding carbohydrate-binding module classified as CBM2, represents the first described LPMO that is active on cellulose. It was shown that CelS2 stimulates the release of soluble sugars from filter paper by Celluclast® (a commercial enzyme cocktail).Papers II and III of this study describe structure-function studies of cellulose-active AA10-type LPMOs with the purpose of unraveling the basic characteristics of these proteins and perhaps identify factors determining substrate specificity and the regioselectivity of hydroxylation (C1 versus C4 oxidation). Paper II describes a comparative study of four C1-oxidizing LPMOs, two of which are active on chitin and two on cellulose, and includes the description of one novel chitin-active LPMO10 (BlLPMO10A from Bacillus licheniformis) and one novel cellulose-active LPMO10 (E8 from Thermobifida fusca). Sequence analysis showed that all residues in the immediate copper coordination sphere were conserved in these four LPMOs. Conversely, electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) analyses indicated that the electronic environments of the copper differed between the chitin- and cellulose-active LPMOs. The differences in the EPR spectra are thus likely to reflect variation in residues outside the direct copper coordination sphere, where the chitin-active and cellulose-active AA10-type of LPMOs indeed show considerable variation.Paper III presents the first crystal structures of cellulose-active AA10-type LPMOs, which allowed for the first time a structural comparison of LPMOs with different substrate specificities. The two S. coelicolor LPMO for which the structures were determined, CelS2 and ScLPMO10B, represent a conserved pair of LPMOs found in cellulolytic actinomycetes. The two enzymes are pregulated during growth on cellulose substrates and we show that they act synergistically when degrading cellulose. CelS2 shows strict C1- oxidation on cellulose substrates, whereas ScLPMO10B catalyzes oxidation of C1 and C4 in cellulose, as well as C1-oxidation on β-chitin. A structural comparison of the two cellulose-active LPMO10s revealed a difference in the copper oordination sphere that may relate to the (in)ability to oxidize C4. Structural comparisons of chitin-active and celluloseactive LPMO10s revealed a potential binding-pocket for a C2 acetamido group in chitinactive LPMO10s only. All LPMO10s had similar redox potentials and copper binding affinities, but showed a substrate-dependent difference in EPR spectra, as discussed in Paper II. Substrate-specificity thus seems to be determined by variation in substrate-binding and –positioning combined with variation in the electronic structure of the copper site. In conclusion, this study represents the discovery and first in-depth characterization of LPMOs from family 10 of auxiliary activities that are active on cellulose. The work presented here has provided fundamental insight into how these enzymes work and contributed to method development, thereby constituting an important basis for future LPMO research.