Evaluation of Liquid Array Diagnostics for microbiota-based diagnosis of dysbiosis

English. The human gut contains a complex community of microorganisms that impact our health and general well-being. Based on observed microbial patterns, a balanced composition can be defined, known as normobiosis. Deviations from such a state is termed dysbiosis and have been linked to several medical conditions. A current assay designed for detection of dysbiosis is the GA-map® Dysbiosis Test. This test is quite specific and efficient, but also relatively labor-intensive and expensive, which has led to the desire to supplement the solid-phase platform that is currently being used with a liquid one. This thesis aimed to investigate the possibility of such a supplement by testing 20 of the labelling probes (LPs) used in the current GA-map® Dysbiosis Test with a novel technology called Liquid Array Diagnostics (LAD). This technology is based on a combination of Single Nucleotide Primer Extension and High Resolution Melting. The entire process takes place in solution, and does not include a purification and separation step, making the technology more efficient and less prone to contamination than many other genotyping methods on the market today.Complementary reporter probes were designed for the 20 LPs, so that each probe duplex had a specific melting temperature. To investigate the compatibility of the probes with LAD they were tested on pure cultures of target bacteria. LAD was then performed on a more complex sample containing 11 different bacterial templates to ensure distinguishable probe signals could still be achieved. Finally, LAD was performed on fecal samples that had previously been diagnosed by Genetic Analysis AS, and statistical analyses were conducted to investigate the diagnostic ability of the technology. The results showed that LAD can detect at least 15 targets simultaneously, and it is expected that further optimization will increase this number. In addition, it was demonstrated that LAD can distinguish between normobiosis and dysbiosis, and that most of the probes showed a strong association with one of the two states. This thesis has thus shown that LAD is a promising supplement to the solid-phase platform used in the GA-map® Dysbiosis Test today, although further optimization is needed before the technology can be implemented. LAD requires no bacterial growth, is economical, easy and rapid, and relies only on standard equipment found in most microbiology laboratories. The technology thus has the potential of becoming a highly valuable tool for diagnostics, and can provide important contributions to areas such as personalized treatments, nutrition and precision medicine.

Menneskets tarm inneholder et komplekst samfunn av mikroorganismer som har en direkte innvirkning på vår helse. Basert på observerte mikrobielle mønster kan en balansert sammensetning defineres, kjent som normobiose. Avvik fra en slik balansert tilstand kalles dysbiose og har blitt knyttet til flere sykdommer. En test som har blitt utviklet for påvisning av dysbiose er GA-map® Dysbiosis Test. Denne testen er svært spesifikk og effektiv, men også relativt arbeidskrevende og dyr, noe som har ført til ønsket om å supplementere fast-fase plattformen som brukes i dag med en flytende en. Hensikten med denne oppgaven var å undersøke muligheten for et slikt supplement, ved å teste 20 av innmerkingsprobene som blir brukt i dagens GA-map® Dysbiosis Test med en ny teknologi kalt Liquid Array Diagnostics (LAD). Denne teknologien er basert på en kombinasjon av Single Nucleotide Primer Extension og High Resolution Melting. Hele prosessen finner sted i løsning og inkluderer ikke et rensing- og separeringssteg, noe som gjør teknologien mer effektiv, samt mindre utsatt for forurensning, enn mange andre genotypingsmetoder på markedet i dag.Det ble først laget komplementære deteksjonsprober til de 20 innmerkingsprobene, slik at hvert probepar hadde et spesifikt smeltepunkt. For å undersøke probenes kompatibilitet med LAD ble de testet på renkulturer av målbakterier. Deretter ble LAD utført på en mer kompleks prøve som inneholdt 11 forskjellige bakteriekulturer for å sikre at tydelige signaler fortsatt kunne oppnås. Til slutt ble LAD testet på avføringsprøver som tidligere hadde blitt diagnostisert av Genetic Analysis AS, samt at statistiske analyser ble utført for å undersøke LADs diagnostiserende evne. Resultatene i denne oppgaven viste at LAD kan identifisere minst 15 mål samtidig, og det er forventet at videre optimalisering vil øke kapasiteten ytterligere. I tillegg ble det demonstrert at LAD kan skille mellom normobiose og dysbiose, og de fleste probene viste en sterk assosiasjon med en av de to tilstandene. Denne oppgaven har dermed vist at LAD kan være et lovende supplement til fast-fase plattformen som benyttes i dagens GA-map® Dysbiosis Test, selv om videre optimalisering er nødvendig. LAD krever ingen bakteriedyrking, er økonomisk, enkel og rask, og er kun avhengig av standardutstyr som er å finne i de fleste mikrobiologiske laboratorier. Teknologien har potensiale til å bli et svært verdifullt verktøy for diagnostisering, og kan i tillegg gi viktige bidrag til områder som personlig tilpasset behandling, ernæring, og presisjonsmedisin.

M-BIOTEK