Giftighet av biocider og blandinger av disse for algen Chlamydomonas reinhardtii | Toxicity of single biocides and their mixtures in the algae Chlamydomonas reinhardtii

Vannlevende organismer er utsatt for en rekke organiske forbindelser, inkludert biocider.Disse forbindelsene er mye brukt blant annet som desinfeksjonsmidler, i bunnstoff, ellersom konserveringsmidler. Biocider kan stamme fra ulike kilder som landbruk, urban ogindustriell avrenning. Deres tilstedeværelse i det akvatiske miljøet er bekymringsverdigda de kan være svært giftige til målorganismer, men også arter de ikke er utviklet for åpåvirke. Hver type biocid har spesifikke effekter i henhold til sin virkningsmekanisme(MoA). I tillegg eksisterer disse stoffene i komplekse blandinger og påvirke organismergjennom kombinasjonsgiftighet. Dette studiet hadde til hensikt å karakterisere effekten avenkeltstoffer og blandinger av de fem miljørelevante biocidene aclonifen, bifenox,diklofluanid, metribuzin og triklosan på den encellede algen Chlamydomonas reinhardtii.Giftigheten av biocidene ble undersøkt ved å analysere deres effekter på ferskvannsalgengjennom tre forskjellige giftighetsmekanismer: hemming av vekst, hemming avfotosystem II (PSII) effektivitet og dannelse av reaktive oksygenarter (ROS).Vurderingen av kombinasjonseffekter ble utført ved bruk av prediksjonsmodeller basertpå konsentrasjonaddisjon (CA) og uavhengig samvirkeinteraksjon (IA) for å analysereom forbindelsene i en blanding skyldes effekten av samme eller ulikvirkningsmekanisme. For forbindelsene/blandinger der MoA og skadeeffekter blekartlagt, ble såkalte Adverse Outcome Pathways (AOP) utviklet for å samle, organisereog vurdere relevant informasjon. Resultatene ble også brukt til å vurdere den potensiellerisikoen av biocidene på alger når tilstede som enkeltstoffer og i blandinger ved hjelp avberegning av risikokvotienter (RQ) og toksiske enheter (TU).Testen for veksthemming i alger verifiserte den generelle toksisitet av hvert biocid ogblanding av disse. Giftighetspotensialet til de ulike stoffene var: bifenox> metribuzin>diklofluanid> aclonifen> triklosan. Modellen for uavhengig samvirkeinteraksjonpredikerte effekten av alle biocidene ved 48 og 72 timer, og antydet at forbindelsenehadde ulike MoA. En potensiell antagonisme ble observert etter 24 timer eksponering forlave til intermediære effektnivåer, trolig på grunn av at forbindelsene hadde ulik evne til å gi effekter på organismenivå (vekst hemming). I dette studiet ble det påvist atmetribuzin, diklofluanid, bifenox og triklosan hadde en potensiell risiko i forhold tilalger, selv om risikoen av diklofluanid muligens var overestimert pga. mangel påtilstrekkelig eksponerings-informasjon. Blandingen med alle forbindelser viste seg årepresentere en potensiell miljørisiko for alger.Av de 5 testede forbindelsene (aclonifen, bifenox, diklofluanid, metribuzin og triklosan)var det bare aclonifen og metribuzin som ga effekter på PSII effektivitet, der aclonifenvar den mest giftige. Denne effekten viste godt samsvar med veksthemming, som viser atinhiberingen av PSII var den viktigste MoA for disse forbindelsene. Virkningene av denbinære blandingen ble best beskrevet av IA, noe som var i samsvar med at disseherbicidene ga additive effekter og hadde ulik MoA. For veksthemming ga IA besttilpasning til de eksperimentelle data i begynnelsen av eksponeringen, mens CA ga besttilpasning til effektdataene ved lengre eksponering. Et konsentrasjonsavhengig avvik fraadditivitet, tolket som synergi, ble observert for middels til høye konsentrasjoner avdenne blandingen. Mens de enkelte forbindelser ikke utgjorde en risiko for alger vedmiljørelevante konsentrasjoner, var effekten av den binære blanding høyere enn forventetog representerte en potensiell miljørisiko for algene.Dannelsen av ROS er en potensiell MoA for aclonifen og metribuzin og medførte at ethøy-kapasitetsassay for deteksjon av ROS ble brukt for å analysere effekten av de 5forbindelsene (aclonifen, bifenox, diklofluanid, metribuzin og triklosan). Av dissebiocidene var det bare aclonifen, bifenox og metribuzin som indusert ROS på ensignifikant og konsentrasjonsavhengig måte. Samvirkeeffekten av de tre herbicidene bleogså undersøkt i binære og ternære blandinger. De beste prediksjonene ble oppnådd vedbruk av CA modellen for den ternære (alle tre stoffene) og binære blandingen avaclonifen og bifenox med lav til intermediære effektnivåer, mens synergisme bleobservert ved høyere effekternivåer. Den binære blanding av aclonifen og metribuzin blebeste predikert av IA-modellen, mens den binære blanding av bifenox og metribuzin varpredikert like godt av de to modellene. Ble foreslått at en kombinasjon av ROS dannelseog inhibering av fotosyntesen kunne forklare de observerte blandingseffektene. Dette arbeidet viste at C. reinhardtii er en velegnet modellorganisme for å vurderegiftigheten av biocider og deres blandinger. De anvendte metodene var i stand til åbestemme både subletale og letale effekter av forbindelsene testet og ga en bedreforståelse av deres MoA. CA og IA-modellene ga gode prediksjoner av de observerteblendingseffektene med lik og ulik MoA. Den kumulative risikovurdering ved bruk avTUs og RQs baserte tilnærminger viste seg å være en relevant måte å forutsimiljørisikovurdering av biocidblandinger.Dette arbeidet har bidratt til å utvikle økotoksikologisk forskning ved å gi en bedreinnsikt i MoA til vanlig anvendte biocider, avdekke sammenhengen omkombinasjonseffekter av enkle blandinger av disse, og identifisere hvorvidt dissebiocidene og deres blandinger utgjør en risiko for alger under økologisk relevanteeksponeringssituasjoner. Gitt den begrensede datatilgjengeligheten for disse biocidenehar kunnskap samlet i dette arbeidet bidratt til karakterisere deres MoA og undersøkeøkotoksikologiske effekter i C. reinhardtii. Denne informasjonen kan samlet benyttes tilå videreutvikle risikovurderingsverktøy og dermed bedre både kunnskapen om risiko ogvern av organismer i det akvatiske miljøet.

English. Aquatic organisms are exposed to several organic compounds including biocides. Thesecompounds are widely used, for instance as disinfectants, in antifouling paints, or asmaterial preservatives. Biocides can originate from different sources such as agricultural,urban and industrial runoff. Their presence in the aquatic environment is cause ofconcern, as they can be highly toxic, not only to target, but also to non-target organisms.Each type of biocide has specific effects according to its mode of action (MoA).Additionally, they may exist in complex mixtures and affect organisms through combinedtoxicity. This study intended to characterise the single and combined effects of fiveenvironmentally relevant biocides, aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin andtriclosan on the unicellular algae Chlamydomonas reinhardtii.Biocide toxicity was examined by analysing their effects in the freshwater microalgaethrough three different toxic endpoints: inhibition of growth, Photosystem II (PSII)efficiency and formation of Reactive Oxygen Species (ROS). The combined toxicityassessment was conducted using the concentration (CA) and independent action (IA)prediction models to analyse if the compounds in a mixture caused toxicity by similar ordissimilar MoA, respectively. For the compounds/mixtures which MoA and adverseoutcomes were understood, preliminary Adverse Outcome Pathways (AOPs) weredeveloped to collect, organize and evaluate all the relevant information. The results werealso used to assess the potential environmental risk of the biocides to algae when presentas single chemicals and in mixtures, by using a Risk Quotients (RQs) and Toxic Units(TUs) approach.The growth inhibition test allowed verifying the general toxicity of each biocide and ofthe mixture with all the compounds. The order of toxic potency was: bifenox>metribuzin> dichlofluanid> aclonifen> triclosan. The IA model best predicted themixture involving all the biocides at 48 h and 72 h, thus suggesting that the compoundshad different MoA. A potential antagonism was observed particularly at 24 h for low tomedian effect levels, possible due to the fact that the different compounds required longer time to propagate the effects to the apical level (growth). In this study, metribuzin,dichlofluanid, bifenox and triclosan showed a potential risk to algae, although the risk bydichlofluanid might be overestimated due to lack of adequate exposure information. Themixture with all the compounds presented a potential environmental risk for algae.From the 5 tested compounds (aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin andtriclosan), only aclonifen and metribuzin showed effects on the PSII efficiency, with thefirst being the most toxic. This effect was correlated with the inhibition of growth,showing that the inhibition of PSII was the main toxic MoA for these compounds. Theeffects of the binary mixture were best described by the IA model, consistent with theseherbicides displaying additive effects by dissimilar MoA. For the growth, IA best fittedthe data in the beginning of exposure, whereas the data was best predicted by CA atlonger exposures. A concentration-dependent deviation from additivity, interpreted assynergy, was observed for medium to high concentrations of this mixture. While thesingle compounds did not present a risk at environmentally relevant concentrations, theeffects of the binary mixture were higher than expected and a potential environmentalrisk was identified.The formation of ROS was a potential MoA for aclonifen and metribuzin; therefore, ahigh-throughput assay for ROS detection was used to analyse the 5 compounds(aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin and triclosan). Among these, onlyaclonifen, metribuzin and bifenox induced ROS in a significant and concentrationdependentmanner. The combined effects of the three herbicides were also studied inbinary and ternary mixtures. The best predictions were achieved by the CA model whentesting the ternary mixture and the binary mixture of aclonifen and bifenox at low tomedian effect levels, whereas synergism was observed at higher effects levels. The binarymixture of aclonifen and metribuzin was best predicted by the IA model, while the binarymixture of bifenox and metribuzin was equally well predicted by the two models. Thecombination of ROS formation and inhibition of photosynthesis was proposed to explainthe observed combined effects. The present work demonstrated that C. reinhardtii is a suitable model organism toevaluate the toxicity of biocides and their mixtures. The applied methods were able todetermine both sublethal and lethal effects of the studied compounds and provided abetter understanding on their MoA. The CA and IA models provided good predictions forthe observed effects of the mixtures of biocides with similar and dissimilar MoA. Thecumulative risk assessment using TUs and RQs based approaches were shown to be anapplicable way for predicting the risk of the biocides mixtures to algae.The present work has contributed to advance the field of ecotoxicology by providing abetter understanding of the MoA of commonly used biocides, deciphering the combinedtoxicity of simple mixtures of these and identifying whether these biocides and theirmixtures represent a risk to algae under ecological relevant exposure scenarios. Given thelimited data available on the studied biocides, the knowledge gathered in the presentwork contributed to the characterization of their MoA and ecotoxicological effects in C.reinhardtii. This information can be integrated to further develop risk assessment toolsfor a better understanding and protection of the aquatic environment.