Microbes meet real-life : understanding how denitrifying bacteria handle nutrient limitation : a prerequisite for novel N2O mitigation options

Dinitrogenoksid (N2O) er den tredje viktigaste klimagassen etter CO2 og metan, og er ein viktig bidragsyter til øydelegginga av ozonlaget. Globale N2O-utslipp er aukande, og mesteparten av utsleppa som er knytt til menneskeleg aktivitet kjem frå denitrifikasjon i landbruksjord. Denitrifikasjon er ein anaerob respirasjonsstrategi som finst hos mange mikroorganismar. Fullstendig denitrifikasjon er ein stegvis reduksjon av nitrat (NO3-) via nitritt (NO2-), nitrogenmonoksid (NO) og dinitrogenoksid (N2O) til dinitrogengass (N2). Kvart av reduksjonsstega er katalysert av ei gruppe denitrifikasjonsreduktaser, høvesvis Nar og/eller Nap, NirS eller NirK, Nor og NosZ klade I eller klade II. NosZ er det einaste enzymet som er kjend å kunne redusera N2O til N2, og det finst berre i prokaryotar. Bakteriar kan dermed tene som soldatar i kampen mot aukande N2O-utslepp.Det er fleire faktorar som verkar inn på ein organismes potensial for N2O-reduksjon. Det genetiske potensialet for denitrifikasjon varierer mellom organismar, og det er berre nokre som har det genetiske potensialet for N2O-reduksjon. Sjølv organismar som har nosZ genet har ulike potensial for å vere sterke N2O-sluk, som mellom anna kan vere grunna metabolsk regulering. Ei slik regulering vart oppdaga i ein studie av bradyrhizobia-stammer som hadde det genetiske potensialet for komplett denitrifikasjon, men berre hadde Nap for dissimilatorisk reduksjon av nitrat. Under kultiveringar med både nitrat og N2O tilgjengeleg reduserte cellene nesten utelukkande N2O. Den komplette denitrifikanten Paracoccus denitrificans, med både Nar og Nap for dissimilatorisk nitratreduksjon, viste ikkje denne preferansen for N2O. Det vart hypotetisert at dette kom av ein elektronkonkurranse mellom NapC og bc1-komplekset, som donerer elektron til høvesvis Nap og NosZ. Det vart føreslådd at bc1-komplekset var ein sterkare konkurrent for elektron enn Nap, i tillegg til at NosZ klade I kunne få ekstra elektron frå proteinet NosR. Dette førte i følgje hypotesa til at cellene med Nap som einaste dissimilatoriske nitratreduktase utviste ein sterk N2O-reduksjon.I mitt arbeide har eg studert denitrifikasjon i fire bakteriestammer. Tre av stammene, frå slekta Thauera, hadde Nap som einaste reduktase for dissimilatorisk nitratreduksjon, medan Pseudomonas stutzeri JM300 hadde både Nap og Nar. Alle stammene var komplette denitrifikantar. Gjennom detaljert overvaking av gasskinetikken til denitrifiserande celler har eg vist at elektronkonkurransen mellom NapC og bc1-komplekset truleg er eit generisk fenomen funne i fleire slekter. Resultata mine indikerer òg at NosZ-kladen som er involvert i denitrifikasjon er essensiell for utfallet av elektronkonkurransen, og at NosZ klade I har eit sterkare potensial for å motta elektron enn NosZ klade II, truleg grunna elektrontransport via NosR.Komplette denitrifikantar med Nap som den einaste dissimilatoriske nitrat-reduktasen er verdfulle kandidatar for å redusere utsleppa av N2O frå jord. Jordmikroorganismar lev ofte med svært avgrensa tilgang på næring, og vi veit lite om korleis dette påverkar utfallet av denitrifikasjon. Arbeidet mitt har derfor inkludert gassovervaking av denitrifiserande celler som var svelta for karbon. Resultata var optimistiske for bruk av mikroorganismar for å redusere N2O-utslepp, og viste at sjølv svelta celler kan vere sterke N2O-sluk.

English. Nitrous oxide (N2O) is the third most important greenhouse gas after CO2 and methane, and it serves as an important destructor of the ozone layer. Global N2O emissions are rising, and most of the anthropogenic N2O comes from denitrification in agricultural soils. Denitrification is an anaerobic respiratory pathway found in many microorganisms. Complete denitrification is the stepwise reduction of nitrate (NO3-) via nitrite (NO2-), nitric oxide (NO) and nitrous oxide (N2O), to dinitrogen gas (N2). Each of the reduction steps are catalysed by a group of denitrification reductases, Nar and/or Nap, NirS or NirK, Nor and NosZ cladeI or clade II, respectively. NosZ is the only enzyme known to reduce N2O to N2, and it is only found in prokaryotes. Bacteria can therefore serve as important soldiers in the battle against increasing N2O emissions. There are several factors that contribute to an organism’s potential for N2O reduction. The genetic potential for denitrification varies between organisms, and only some carry the genetic potential for N2O reduction. Even organisms that carry the nosZ gene have different potentials to serve as strong N2O sinks, which can be due to metabolic regulation. One such regulatory mechanism was discovered in studies of bradyrhizobial strains which carried the genetic potential for complete denitrification, but had Nap as the only reductase for dissimilatory nitrate reduction. When cultivated in the presence of both N2O and nitrate, the cells reduced N2O almost exclusively. The complete denitrifier Paracoccus denitrificans, with both Nar and Nap for dissimilatory nitrate reduction, did not show this preference for N2O. This was hypothesised to be due to an electron competition between NapC and the bc1-complex, which donates electrons to Nap and NosZ, respectively. The bc1-complex was proposed to be a better competitor for electrons, and it was proposed that NosZ clade I got additional electrons from the protein NosR. This was hypothesised to cause the preferred reduction of N2O in cells with Nap as the only dissimilatory nitrate reductase. In my work, I have studied denitrification in four bacterial strains. Three strains, from the genus Thauera, had Nap as the only dissimilatory nitrate reductase, whereas Pseudomonas stutzeri JM300 had both Nap and Nar. All strains were complete denitrifiers. Through detailed monitoring of the cells’ gas kinetics during denitrification, I have shown that the electron competition between NapC and the bc1-complex is likely a generic phenomenon found in several genera. My results also indicate that the NosZ clade involved in denitrification is essential for the outcome of the electron competition, and that NosZ clade I has a stronger potential to receive electrons than NosZ clade II, likely due to electron transport via NosR.Complete denitrifiers with Nap as the only dissimilatory nitrate reductase are valuable candidates for mitigating N2O emissions from soils. However, soil microbes live under conditions with limited nutrients available. Very little is known about how this affects the outcome of denitrification. My work therefore included gas monitoring denitrification from cells that were starved for carbon. The results were optimistic with regards to using microorganisms to mitigate N2O emissions, and showed that even starved cells can serve as powerful N2O sinks.

M-BIOTEK