Comparison of Verticillium dahliae diagnostic methods in olive tree: isolation in culture media and PCR | Comparación de métodos de diagnóstico de Verticillium dahliae en olivo: aislamiento en medio de cultivo y PCR

Spanish; Castilian. El aislamiento de Verticillium dahliae en medio de cultivo está muy asociado a la presencia de síntomas, siendo la primavera y principios de verano la mejor época para su aislamiento. Plantas de olivo asintomáticas pueden estar infectadas por el patógeno y por ello es necesario el desarrollo de métodos de diagnóstico adecuados para su detección en las mismas. El objetivo de este trabajo era poner a punto un método para la detección de V. dahliae que pudiera ser utilizado en el Plan experimental de certificación de plantas de olivo en Andalucía. En los últimos años se han descrito algunas parejas de iniciadores de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) utilizados para el diagnóstico o la caracterización de las distintas especies de Verticillium. El método seleccionado consiste en una "nested-PCR" que amplifica una región de 140 pb de ADNr mitocondrial solo en el caso de V. dahliae. Para comprobar la eficacia de este método se comparó con el de aislamiento en medio de cultivo y se observó su comportamiento en las distintas estaciones del año en muestras de olivos infectados naturalmente, con y sin síntomas. Se usó el método con ADN extraído de cultivos monospóricos y de material vegetal de varias plantas con síntomas de verticilosis, obteniéndose en todos los casos el fragmento de ADN esperado. Para comparar los dos métodos se analizaron 560 muestras de las cuales 441 eran asintomáticas, 74 tenían síntomas frescos y 45 síntomas antiguos y estaban muy secas. El método de PCR resultó claramente más eficaz en la detección del patógeno en muestras asintomáticas y en muestras sintomáticas muertas. En las muestras sintomáticas vivas la frecuencia de detección por PCR fue también mejor que por aislamiento en medio de cultivo. El número de positivos obtenidos por PCR, aunque era mayor que por cultivo, también sufría un descenso en los meses de invierno y verano, siendo por tanto la primavera y el otoño las fechas más adecuadas para la detección de este patógeno. El método de PCR resultó ser más sensible que el de aislamiento en medio de cultivo por lo que se propone su uso en el Plan experimental para la obtención y control de variedades certificadas de plantas de vivero de olivo en Andalucía.

English. Isolation of Verticillium dahliae by culture media is associated to symptoms presence. The best seasons for isolation are spring and early summer. Nonsymptomatic olive plants can be infected as well, so, development of diagnostic methods suitable for detection of the pathogen makes sense at this point. The objective of this study was to develope a method for V. dahliae detection to be used in $quot;Experimental plan of olive plant certification in Andalucia". Last years some PCR (Polymerase Chain Reaction) primers have been used for diagnostic and characterization of different species of Verticillium. A PCR method was selected that consists in a nested-PCR that amplifies a 140 bp region of mitochondrial rDNA only if V. dahliae is present in the sample. Method efficiency was checked by comparing it with traditional method of culture media isolation and analysing the seasonal evolution with naturally infected olive samples, with and without symptoms. Firstly, DNA isolated from monosporic cultures and from some symptomatic plants tissues was used and the expected size fragment was obtained in all cases. Secondly, to compare both methods, 560 samples were analysed. 441 samples were nonsymptomatic, 74 samples had fresh symptoms and 45 samples had old symptoms and their plant tissues were dry. PCR method was more effective detecting the pathogen in symptomless samples and in death symptomatic samples. In symptomatic fresh samples PCR detection frecuency was also better than using culture media isolation method. Despite the fact that amount of PCR positives has been greater than culture positives, they decreased in winter and summer, confirming spring and autumn as the best seasons to detect this pathogen. PCR method was more sensitive than culture media isolation method, so it has been proposed as reference method in the "Experimental plan for obtention and control of certificated cultivars of nursery olive plants in Andalucia".