Effects of bedding materials on equine airway inflammation

Equine asthma (EA) is a chronic lower airway disease that affects 10–20% of adult horses in the Northern Hemisphere, making it a major welfare issue. Inhaled particles, such as moulds and pollens, play a crucial role in its pathogenesis. As many horses spend a considerable portion of their lives indoors, the factors that affect stable air quality come into play. Although the effects of hay quality on EA have been long acknowledged, the effects of bedding materials have been studied less. Peat, which has traditionally been a popular bedding material for horses in Nordic and Baltic countries, has been investigated minimally from this perspective.   The main diagnostic tool for EA in practice is bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cytology. The technique has some weaknesses, and the cut-off values for inflammatory cell proportions have been debated. More sensitive diagnostic methods are thus desired. The field of lipidomics is still rather an unexplored territory in equine medicine. Studying the lipidome offers an in-depth view into inflammation, as many proinflammatory and proresolving inflammatory mediators are lipids. The three studies in this thesis are based on one clinical experiment. The objective of study I was to investigate whether bedding material (peat vs. wood shavings/WS) influences clinical respiratory variables, tracheal mucus score and lower respiratory tract cytology of healthy horses. The objectives for studies II and III were formulated based on the results from study I. The objective of study II was to compare different bedding materials to the peat bedding that was used in study I. The objectives of study III were to explore the BALF cells’ lipidome in horses for the first time, and to identify lipids associated with progression or resolution of airway inflammation. The experiment was a prospective controlled study in which 32 healthy adult horses were exposed to different bedding materials over a period of one in-housing season. Each bedding material was used for 35 consecutive days in the following order: baled peat (Peat 1), WS, baled peat (Peat 2), wood pellet (WP), a mixture of baled and loosely stored peat (Peat 3), straw pellet, loosely stored peat (Peat 4). During the experiment, horses were stabled in a single stable and fed haylage with some concentrate feed. Horses spent part of the day on an outdoor paddock and were used as riding school teaching horses. During the experiment horses acted as their own controls. Clinical signs of respiratory disease were monitored daily. The cytology of lower airway samples (tracheal wash [TW], BALF) was examined after each bedding period and the relative proportions of inflammatory cells were compared. Lipid profiling of the BALF cells were then conducted comparing BALF cells that were collected after Peat 1, WS, and Peat 2.   Study I compared WS to peat. The hypothesis was that peat induces less airway inflammation than WS. No difference between bedding periods was observed in the respiratory rate (RR) or tracheal mucus score. TW neutrophil percentage (neutr%) with WS was higher than Peat 1 (P = 0.040) and Peat 2 period (P = 0.0045. BALF neutr% with WS was higher than that of Peat 2 period (P < 0.001). Between the two bedding materials used in this study, peat was associated with lower BALF and TW neutr%.   In study II, results from study I were further explored. WP, straw pellet, and loosely stored peat (Peat 3) were compared to Peat 2 from study I. The hypothesis was that peat induces less airway inflammation than straw pellets or WP. The tracheal mucus scores (P = 0.014) and RR (P = 0.026) were higher during the straw pellet period than during Peat 2 period. RR was lower during WP than during Peat 2 period (P = 0.004). TW neutr% during straw pellet period was higher than during Peat 2 period (P = 0.0003). BALF neutr% was higher during the straw pellet period (P = 0.005) and during Peat 3 period than during Peat 2 period (P = 0.04). In conclusion of this study, baled peat (Peat 2) resulted in lower neutr% in the airway samples than with straw pellet and loosely stored peat (Peat 3). No difference was observed between Peat 2 and WP. The information gained from studies I and II may assist veterinarians and horse owners in selecting bedding materials, especially for horses suffering from EA.  In study III, lipidomic analysis of the BALF cells was performed using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach. Lipid species profiles of equine BALF cells indicated changes in airway inflammation between the bedding periods. Differences between the bedding periods were found in the molar percentage (mol%) of 60 individual lipid species. Phosphatidylcholine (PC) mol% was higher after Peat 2 period than after WS period (P < 0.001). PC 32:0 (main molecular species 16:0_16:0) was higher after Peat 2 period than after WS period (P < 0.001). Phosphatidylinositol (PI) 38:4 (main molecular species 18:0_20:4) was higher after WS period than after both peat periods (P = 0.004). BALF cell count (cells/µ l) correlated positively with PI 38:4. The results of this study indicate that numerous specific lipids may contribute to the process of airway inflammation in horses. Mass spectrometry-based lipidomics was used for the first time on equine BALF cells. Based on these results, this technique may be a sensitive tool to detect and monitor resolution of inflammation in equine airways. On top of these three studies, a pilot study exploring a possible link between obesity/insulin dysregulation and airway inflammation was conducted. The objective of this fourth study was to investigate the association between airway neutrophilia and obesity and/or insulin dysregulation (ID) in healthy adult horses. No associations between these phenomena were found in this study population (unpublished material). Altogether, these studies provide new information about the effects of common bedding materials on equine airway inflammation. Studies I and II indicate that peat is a suitable bedding material when horse airway health is considered. Study III describes for the first time the lipidome of equine BALF cells.

Hevosen astma on krooninen alahengitystiesairaus, jota sairastaa 10–20 % aikuisista hevosista pohjoisella pallonpuoliskolla. Inhaloitavat pienhiukkaset, kuten homeet ja siitepöly, ovat tärkeitä tekijöitä sairauden synnyssä. Monet hevoset viettävät suuren osan elämästään sisätiloissa, joten talli-ilman laatuun vaikuttavat tekijät ovat tärkeässä roolissa hevosten astman ennaltaehkäisyssä. Heinän laadun vaikutukset hevosen astmaan on tunnistettu pitkään, kun taas kuivikemateriaalien vaikutuksista tiedetään vähemmän. Turve on perinteisesti ollut suosittu kuivikemateriaali Pohjoismaissa ja Baltian maissa, mutta sitä on tutkittu hyvin vähän.   Tärkein menetelmä hevosen astman diagnosoinnissa on keuhkohuudenäytteen sytologinen tutkimus. Menetelmässä on heikkouksia: muun muassa yleisesti käytettyjä raja-arvoja tulehdussolujen prosenttiosuuksille on kyseenalaistettu. Herkemmät diagnostiset keinot hevosten hengitysteiden tulehdusreaktion toteamiseksi ovat toivottuja. Lipidomiikka tarjoaa syväluotaavan näkökulman tulehdusreaktioon, koska monet tulehdusta voimistavat ja lieventävät välittäjäaineet ovat lipidejä. Väitöskirjan kolme osatyötä perustuvat yhteen kliiniseen kokeeseen. Osatyön I tavoitteena oli tutkia, vaikuttaako kuivikemateriaali (turve vs. kutteri) kliinisiin hengitystieoireisiin, trakealiman määrän luokitukseen ja alempien hengitysteiden sytologiaan terveillä hevosilla. Osatöiden II ja III tavoitteet muodostettiin osatyön I tulosten perusteella. Osatyön II tavoitteena oli verrata eri kuivikemateriaaleja osatyössä I käytettyyn turpeeseen. Osatyön III tavoitteina oli tutkia hevosten keuhkohuuhteen solujen lipidomia ensimmäistä kertaa, sekä tunnistaa lipidejä, jotka ovat yhteydessä tulehdusreaktion voimistumis- tai paranemisvaiheeseen. Kliinisessä, prospektiivisessa, kontrolloidussa kokeessa 32 aikuista, tervettä hevosta altistettiin yhden sisäruokintakauden ajan eri kuivikemateriaaleille. Jokaista kuivikemateriaalia käytettiin 35 päivän ajan seuraavassa järjestyksessä: muoviin pakattu turve (Turve 1), kutteri, muoviin pakattu turve (Turve 2), puupelletti, muoviin pakatun turpeen ja aumaturpeen sekoitus (Turve 3), olkipelletti, aumaturve (Turve 4). Kokeen ajan hevoset asuivat samassa tallissa ja niitä ruokittiin esikuivatulla säilöheinällä sekä väkirehulla tarpeen mukaan. Hevoset toimivat omina kontrolleinaan. Hengitystieoireita seurattiin päivittäin. Hevosilta otettiin alahengitystienäytteet (trakealimanäyte, keuhkohuuhde) jokaisen kuivikejakson jälkeen. Näytteistä tehtiin sytologinen tutkimus, jossa tutkittiin tulehdussolujen suhteellisia osuuksia. Lipidomiikka-analyysissa verrattiin Turve 1-, kutteri- ja Turve 2- jaksojen jälkeen otettujen keuhkohuuhteiden solujen lipidiprofiileja. Osatyössä I verrattiin kutteria muoviin pakattuun turpeeseen. Hypoteesina oli, että turve aiheuttaa vähemmän alahengitysteiden tulehdusreaktiota kuin kutteri. Hevosten hengitystiheydessä tai trakealiman määrässä ei havaittu eroja kuivikejaksojen välillä. Trakealimanäytteessä neutrofiilisten granulosyyttien prosenttiosuus kutterijakson jälkeen oli korkeampi verrattuna Turve 1- jaksoon (P = 0.040) ja Turve 2- jaksoon (P = 0.0045). Keuhkohuuhteessa neutrofiilisten granulosyyttien prosenttiosuus kutterijakson jälkeen oli korkeampi verrattuna Turve 2- jaksoon (P < 0.001). Tässä tutkimuksessa käytettyjä kahta kuivikemateriaalia verratessa turve aiheutti vähemmän neutrofiilistä tulehdusreaktiota hevosten hengitysteissä kuin kutteri.  Osatyössä II jatkettiin tutkimusta osatyön I tuloksiin pohjautuen. Puupellettiä, olkipellettiä ja aumaturvetta (Turve 3) verrattiin Turpeeseen 2. Alahengitysteiden tähystys ja näytteenotto tehtiin jälleen jokaisen kuivikejakson jälkeen. Trakealiman määrä (P = 0.014) ja hengitystiheys (P = 0.026) olivat korkeammat olkipellettijakson jälkeen verrattuna Turve 2- jaksoon. Hengitystiheys oli matalampi puupellettijakson jälkeen verrattuna Turve 2- jaksoon (P = 0.004).  Trakealimanäytteessä neutrofiilisten granulosyyttien prosenttiosuus oli korkeampi olkipellettijakson jälkeen verrattuna Turve 2- jaksoon (P = 0.0003). Keuhkohuuhteessa neutrofiilisten granulosyyttien prosenttiosuus oli korkeampi olkipellettijakson (P = 0.005) ja Turve 3- jakson (P = 0.04) jälkeen verrattuna Turve 2- jaksoon. Tässä tutkimuksessa muoviin pakattu turve (Turve 2) aiheutti vähemmän neutrofiilistä tulehdusreaktiota verrattuna olkipellettiin ja aumaturpeeseen (Turve 3). Eroja ei havaittu Turve 2- jakson ja puupellettijakson välillä.  Osatöiden I ja II tulokset voivat auttaa eläinlääkäreitä ja hevosten omistajia valitsemaan kuivikemateriaaleja erityisesti astmaatikkohevosille.    Osatyössä III keuhkohuuhteen solujen lipidien määrittäminen tehtiin nestekromatografia-massaspektrometrialla. Keuhkohuuhteen solujen lipidiprofiilien muutokset osoittivat eroja hengitysteiden tulehdusreaktion suhteen kuivikejaksojen välillä. Kuivikejaksojen väleillä todettiin eroja 60 yksittäisen lipidilajin mooliprosenteissa (mol%). Fosfatidyylikoliiniluokan (PC) mooliprosentti (mol%) oli korkeampi Turve 2- jakson jälkeen verrattuna kutterijaksoon (P < 0.001). PC 32:0 mol% (päämolekyylilaji 16:0_16:0) oli korkeampi Turve 2- jakson jälkeen verrattuna kutterijaksoon (P < 0.001). Fosfatidyyli-inositoli 38:4 (päämolekyylilaji 18.0_20:4) mol% oli korkeampi kutterijakson jälkeen verrattuna molempiin turvejaksoihin (P = 0.004).  Keuhkohuuhteen solumäärän (soluja/µl) ja PI 38:4:n välillä oli positiivinen korrelaatio. Tulosten perusteella useat spesifiset lipidit voivat olla osatekijöinä hevosten hengitysteiden tulehdusreaktiossa. Massaspektrometriaan perustuvaa lipidomiikan tekniikkaa käytettiin tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa hevosten keuhkohuuhteen solujen tutkimiseen. Tämä tekniikka voi tarjota herkän menetelmän hevosten hengitysteiden tulehdusreaktion toteamiseen ja tulehdusreaktion resoluutiovaiheen monitorointiin. Kolmen osatyön lisäksi väitöskirjaan sisällytetyssä aiemmin julkaisemattomassa pilottitutkimuksessa tutkittiin hevosten lihavuuden/insuliiniaineenvaihdunnan häiriön mahdollista yhteyttä hengitysteiden neutrofiiliseen tulehdusreaktioon. Tutkimuspopulaatiossa ei todettu yhteyksiä näiden ilmiöiden välillä.

ei saavutettava