Expanding the genetic and chemical biosynthetic diversity of cyanobactin family of natural products

Natural products are small metabolites produced by living organisms with versatile chemical structures and diverse bioactivities. Bacteria are a rich but yet underexplored source of natural products. Natural product biosynthetic pathways encode a huge array of biosynthetic enzymes which can catalyze stereospecific and regiospecific modification of intermediates to produce complex natural products from simple precursors. The biosynthetic mechanisms underlying the production of natural products vary substantially. Cyanobactins are synthesized through the post-translational modification of precursor peptides and represent one of the most abundant natural product classes produced by cyanobacteria. Cyanobactins have a macrocyclic or linear structure with antimicrobial and cytotoxic bioactivities, although their ecological function is unclear. In this study, genome mining was used to catalog the genetic diversity of cyanobactin biosynthetic pathways from bacterial and archaeal genomes. Bioinformatic analysis of microbial genomes was used to identify cyanobactin biosynthetic pathways. New cyanobactin biosynthetic pathways were studied using a combination of bioinformatics, molecular biology, microbiology, biochemistry and structural chemistry. Bioinformatic predictions of cyanobactin biosynthetic gene clusters were performed based on DNA sequence data. Subsequently, candidate strains identified based on the predictions were grown in the laboratory and subjected to mass spectrometric analysis and heterologous expression. Novel cyanobactin natural products were discovered and the enzymes underpinning their biosynthesis were characterized. In the first part of the study, the muscoride biosynthetic gene cluster was described and a new muscoride variant was discovered. Two specific prenyltransferases from the muscoride biosynthetic gene cluster, which were biochemically characterized, catalyzed the regiospesific prenylation of the N- and C-termini of the linear polyoxazole muscorides. In the second part of the study, genome mining revealed a truncated cyanobactin biosynthetic gene cluster across the bacterial and archaeal domains for the production of structurally unusual cyanobactins. In the third part of the study, a regiospecific prenyltransferase was discovered, belonging to the anacyclamide cyanobactin pathway and catalyzing the N-prenylation of the tryptophan residue of the substrate peptide. The main aim of this work was to uncover novel cyanobactin biosynthetic gene clusters from bacteria and expand knowledge regarding the biosynthetic potential of cyanobactin pathways. The results from this thesis broaden the chemical diversity of the cyanobactin family and expand upon the biosynthetic logic underlying cyanobactin biosynthesis.

Luonnonyhdisteet ovat molekyylejä, joita tuottavat kaikki elävät organismit. Näillä yhdisteillä on hyvin monipuolisia rakenteita ja bioaktiivisuuksia. Bakteerit ovat runsas, mutta silti suurelta osin kartoittamaton, lähde luonnonyhdisteille. Luonnonyhdisteiden biosynteesireitit koodaavat valtavan määrän biosynteettisiä entsyymejä, jotka katalysoivat erilaisia muokkausreaktioita tuottaakseen monimutkaisia rakenteita omaavia lopputuotteita. Syanobaktiinit ovat luonnonyhdistepeptidejä, jotka syntetisoidaan translaation jälkeisillä muokkausreaktioilla ja ne ovat yksi suurimmista syanobakteerien tuottamista luonnonyhdisteluokista. Syanobaktiinit ovat kemiallisilta rakenteiltaan syklisiä tai lineaarisia ja niillä on antimikrobisia sekä sytotoksisia bioaktiivisuuksia, vaikkakin niiden ekologinen rooli on vielä epäselvä. Tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin bioinformatiivisella genomilouhinnalla syanobaktiinien biosynteesireittien esiintyvyyttä bakteerien ja arkeonien genomeissa. Uusia syanobaktiinien biosynteesireittejä tutkittiin käyttämällä hyödyksi bioinformatiikkaa, molekulaarista biologiaa, mikrobiologiaa, biokemiaa sekä rakenteellista kemiaa. Syanobaktiineja tuottavat geenit ovat yleensä toistensa lähellä genomissa muodostaen geeniklusterin ja näiden geenien ennustukset tehtiin bakteerien DNA:n sekvensointitietoon perustuen. Kandidaattibakteerikantoja kasvatettiin laboratoriossa ja kasvatuksen jälkeen niitä tutkittiin massaspektrometrialla sekä heterologisella ekspressiolla, jotta saataisiin selville tuottavatko kyseiset bakteerikannat bioinformatiikalla ennustettuja luonnoyhdisteitä. Tässä työssä löydettiin uusia syanobaktiineja, sekä tunnistettiin näiden biosynteesissä tarvittavia entsyymejä. Työn ensimmäisessä osassa tunnistettiin kaksi biosynteettistä geeniklusteria luonnonyhdiste muskoridin tuottamiseen, sekä pystyttiin rakenteellisesti kuvaamaan uusi muskoridi variantti. Muskoridin biosynteettisessä geeniklusterissa on kaksi biokemiallisesti karakterisoitua spesifistä prenyylitransferaasientsyymiä, jotka katalysoivat lineaarisen muskoridin amino- ja karboksiterminaalien prenylaatiota. Työn toisessa osassa bioinformatiivisella genomilouhinnalla löydettiin bakteerien ja arkeonien genomeista tunnustettua lyhyempiä syanobaktiinien biosynteettisiä geeniklustereita, joiden ennustetut lopputuotteet ovat rakenteellisesti uudenlaisia syanobaktiineja. Työn kolmannessa osassa anasyklamidin biosynteettisesta geeniklusterista löydettiin spesifinen prenyylitransferaasientsyymi, joka liittää prenyyliryhmän substraattipeptidin tryptofaanin indolin typpiatomiin. Tämän väitöskirjatutkimuksen päätarkoituksena oli löytää ja karakterisoida uusia syanobaktiinien biosynteettisia geeniklustereita bakteereista sekä laajentaa tietämystä niiden biosynteettisesta potentiaalista. Tämän väitöskirjan tulokset ovat laajentaneet syanobaktiinien kemiallista monimuotoisuutta sekä monipuolistanut tietämystä niiden entsymaattisesta biosynteesistä.