The role of a conserved methyltransferase in growth, sporulation and toxin production of Clostridium botulinum Group I

Botulism is a potentially fatal flaccid paralysis in animals and humans. The disease is caused by botulinum neurotoxins (BoNTs) produced by endospore-forming bacteria of Clostridium botulinum Groups I-IV, or occasionally by Clostridium baratii and Clostridium butyricum. C. botulinum spores prevail in the environment and can contaminate food raw materials. BoNT production may occur in anaerobically stored foods, in the gastrointestinal tract, or in deep wounds. Here we take a novel insight into the regulation of BoNT synthesis through epigenetic control. Epigenetic studies in bacteria focus mostly on DNA methylation catalysed by enzymes called methyltransferases (MTases), which recognize specific DNA sequence motifs and methylate either an adenine or a cytosine base. While most MTases are part of restriction-modification systems involved in defending the cells from foreign mobile DNA elements, there are orphan MTases that methylate DNA to control gene expression. Here we characterized the role of a conserved orphan MTase, M.CboAII, in C. botulinum Group I. In order to unravel the biological role of M.CboAII, a m.cboAII deletion mutant of the proteolytic C. botulinum model strain ATCC 19397 was characterized. The growth, sporulation, cell morphology and neurotoxin production in the Δm.cboAII mutant and its parental strain were compared by measuring the culture density, vegetative cell and spore counts, microscopy, and toxin quantification using an immunological in vitro assay. The mutant showed decreased toxin synthesis and attenuation of sporulation, whereas culture density and cell numbers were similar compared to the parental strain. Further, irregularly shaped mutant cells were detected, which may suggest membrane alterations. Our results suggest that M.CboAII plays a positive role in toxin synthesis and in sporulation. Transcriptomic analysis of ATCC 19397 and Δm.cboAII mutant strains at different stages of growth will help us to uncover the cellular processes controlled by M.CboAII in more detail. Here we take the first glance into epigenetic regulation of cellular processes in C. botulinum. We report a potentially novel regulatory mechanism involved in C. botulinum toxinogenesis and sporulation. Better understanding of these fundamental processes controlling the pathogenicity of C. botulinum may help to develop novel strategies in food and health management in the future.

Botulism är en potentiell livshotande sjukdom för människor och djur. Sjukdomen orsakas av botulinumtoxiner (BoNTs) och kännetecknas av tilltagande slapp förlamning. BoNTs produceras av fyra grupper (I-IV) av sporformande bakterier vid namn Clostridium botulinum eller mera sällan av bakterierna Clostridium baratii och Clostridium byturicum. Sporer av C. botulinum förekommer naturligt i miljön och kan kontaminera livsmedelsråvaror. Produktion av BoNT kan ske i livsmedel som förvaras anaerobt, i matsmältningskanaler samt i djup sårvävnad. I denna studie undersöker vi en outforskad epigenetisk regleringsmekanism hos C. botulinum som kan ge oss en bättre förståelse för hur BoNT produktionen kontrolleras. De flesta studier om epigenetisk reglering hos bakterier fokuserar på DNA-metylering, vilket är en kemisk modifiering som verkställs av metyltransferasenzymer. Dessa enzymer fogar en metylgrupp till antingen adenin eller cytosin i specifika DNA motiv. Många metyltransferaser förknippas med så kallade restriktion-modifikations system som deltar i att försvara bakteriecellen mot inträngande DNA. Därtill finns det ensamt verkande metyltransferaser (eng: orphan MTases) som deltar i att reglera cellprocesser. I denna studie undersöker vi en konserverad sådan i C. botulinum grupp I vid namn M.CboAII. Vi studerade den biologiska rollen av M.CboAII genom att jämföra en mutant som saknar m.cboAII med dess normaltyp C. botulinum ATCC 19397. Tillväxt, sporulering, produktion av neurotoxin och cellmorfologi jämfördes i de två bakteriekulturerna. Vi uppmätte odlingarnas optiska densitet, beräknade cell- och sporantal, kvantifierade BoNT med hjälp av en enzymkopplad immunadsorberande metod samt studerade cellerna i mikroskop. Mutanten visade nedsatt toxinproduktion och hämmad sporulering medan odlingens optiska densitet och cellantalet var liknande i jämförelse med normaltypen. Även tecken på oregelbundet formade mutantceller upptäcktes, vilket möjligtvis tyder på membranförändringar. Resultaten indikerar att M.CboAII påverkar toxinproduktionen samt sporuleringen positivt. Analysering av gentranskriptioner mellan mutanten och normaltypen i de olika tillväxtfaserna kan i framtiden erbjuda mera information om de processer som styrs av M.CboAII. Denna jämförelsestudie rapporterar de första resultaten från en epigenetisk studie i C. botulinum. Här beskriver vi en del av en nyupptäckt regleringsmekanism i toxinproduktionen och sporuleringen. En ökad förståelse för de patogena egenskaperna som kännetecknar C. botulinum kan underlätta framtida utveckling av nya strategier i hälsovården och livsmedelsindustrin.