Influenssa A -Viruksen kaltaisten partikkelien tuottaminen spodoptera frugiperda 9 -hyönteissululinjassa bakulovirustuottovektoria käyttäen

Influenssapandemiaan varauduttaessa, sekä pandeemista ja mahdollisesti hyvin vaarallista virusta tutkittaessa, tarvitaan tiukat turvatoimet työturvallisuuden takaamiseksi ja laboratorioperäisen kontaminaation estämiseksi. Nämä turvatoimet hidastavat tutkimuksen etenemistä ja niiden ylläpito on kallista. Vaarallista virusta tutkittaessa voidaan hyödyntää virusta mimikoivaa viruksen kaltaista partikkelia (virus-like particle, VLP), joka soveltuu ei-infektiivisyytensä vuoksi suojavarusteetta tehtävään tutkimukseen. Lisäksi VLP on yleensä hyvin immunogeeninen, joten se voi sopia myös malliksi rokotekehitykseen. Tutkimusryhmässä on aiemmin tuotettu pandeeminen influenssa A -VLP kloonaamalla hemagglutiniini (HA), neuraminidaasi (NA) - ja matriksiproteiini (M1) -geenit vuoden 2009 pandeemisesta influenssa A -viruksesta (H1N1)v yhteen bakulovirustuottovektoriin. Tässä aiemmassa tukimuksessa havaittiin ongelmalliseksi se, että yksittäisen geenin proteiinituottotasoa ei voitu säädellä. Tässä tutkimuksessa HA-, NA- ja M1-geenit kloonattiin erillisiin bakulovirusstuottovektoreihin, jotta jokaista geeniä ilmentävän virusvektorin määrää (multiplicity of infection, MOI) voitaisiin säädellä yksilöllisesti suhteessa solujen määrään ja yksittäisen vektorin proteiinituottotasoa parantaa plakkipuhdistuksen avulla. Tutkimuksen hypoteesina oli, että eri geenejä ilmentävien vektorien MOI-arvoja säätämällä voitaisiin vaikuttaa VLP:n tuottotasoon Spodoptera frugiperda (Sf9) -soluissa ja löytää tuoton maksimoiva optimaalinen MOI-arvojen yhdistelmä. Bakulovirustuottovektorit valmistettiin kloonaamalla HA-, NA- ja M1 geenit pAcYM1 bakulovirussiirtovektoreihin voimakkaaksi promoottoriksi tiedetyn polyhedriini promoottorin alaisuuteen. Siirtovektoreiden avulla geenit siirrettiin bakulovirusten linearisoituihin perimiin homologista rekombinaatiota käyttäen, ja nämä perimät transfektoitiin Sf9-soluihin rekombinanttisten bakulovirusten, eli tuottovektorien, muodostamiseksi. Tuottovektorit plakkipuhdistettiin ja niiden tiitteriä kasvatettiin. Niiden proteiinituottotasoa tutkittiin käyttäen SDS-PAGE:a ja Coomassie Blue -värjäystä, sekä [S35]-leimatulla metioniinillä tehdyn metabolisen leimauksen avulla. Sf9-solut infektoitiin kaikilla kolmella tuottovektorilla, mikä johti influenssa A VLP:n kuroutumiseen ulos solusta. Kuroutuneen VLP:n määrää tutkittiin hemagglutinaatiotestillä. Muuttamalla tuottovektorien MOI-arvoa välillä 1, 3 ja 5, tutkimuksessa ei havaittu suurta vaikutusta yksittäisen tuottovektorin proteiinituottoon. NA-proteiinin läsnäolo havaittiin välttämättömäksi edellytykseksi hemagglutinaatioaktiivisuutta osoittavan influenssa A -VLP:n muodostamiselle. MOI-arvoja muuttamalla havaittiin eroavaisuuksia VLP:n tuottotasossa, mutta havaintojen merkityksellisyys on aihe lisätutkimukselle. VLP tuoton maksimoivan optimaalisen MOI-arvojen yhdistelmän etsimistä tulee jatkaa.

Great concern is to be addressed to safety measures in order to guarantee work safety when studying novel, possibly pandemic influenza A viruses. These safety measures slow down the research process and their upkeep is expensive. To overcome these hindrances a virus-like-particle (VLP) can be used as a model to replace the need for a live virus. Because VLPs are non-infectious, they are suitable for being used in research where experiments are done with slighter safety precautions. In addition, VLPs are usually highly immunogenic and thus influenza A VLP may function as a model system for further vaccine development. This research was done in a research group, in which a VLP had previously been made with cloning the genes of hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) and matrix 1 (M1) proteins from the year 2009 pandemic Influenza A virus (H1N1)v to a single baculovirus protein expression vector. During this earlier research project it was found problematic that the expression level of a particular gene could not be controlled. In this research, HA, NA and M1 genes were cloned to different baculovirus protein expression vectors so that the expression level of individual genes could be enhanzed with plaque purification and the multiplicity of infection (MOI) adjusted individually for each vector. It was hypothesized that an optimal configuration of MOI rates between vectors could be found in order to maximise VLP production in Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) cells. Baculovirus protein expression vectors were made via traditional cloning of the HA, NA and M1 genes into three pAcYM1 baculovirus transfer vectors under polyhedrin promoter, which has been shown to be a strong promoter. Transfer vectors were used to transfer the genes into linearised baculovirus’ genomes by homologous recombination and the genomes were transfected into Sf9 cells to produce recombinant baculoviruses. These expression vectors were plaque-purified and their titers were amplified. Their expression level was studied using SDS-PAGE and coomassie blue analysis and with metabolic labeling using [S35]-labeled methionine. The formation of VLPs was measured with hemagglutination assay when Sf9 cells were co-infected with all three protein expression vectors. It was found that changing expression vectors MOI between 1, 3 and 5 did not have a great impact on protein expression from individual vectors. The presence of NA protein was found to be necessary for the formation of influenza A virus VLPs with a detectable hemagglutination activity. Differences between VLP formations were obtained when MOI rate compositions were changed, but further study is needed to find the significance of this result. The research to find an optimal configuration of MOI rates between vectors is still to be continued.