Секвенирование промоторов генов U6 клещевины (Ricinus communis L.) и создание на их основе векторов для геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 | Sequencing of the U6 promoters in castor beans and vector construction for CRISPR/Cas9 genomic editing on their basis

Russian. Клещевина - важная с.-х. культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла. Цель исследования - изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины (Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc. Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3. ПЦР проводили на амплификаторе C-100 ('Bio-Rad Laboratories, Inc.', США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT ('Bio-Rad Laboratories, Inc.', США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit ('Thermo Fisher Scientific, Inc.', США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T ('Евроген', Россия). При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI ('Сибэнзим', Россия) и необходимые олигонуклеотиды. Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Промоторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77%. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64%. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов.

English. Castor bean is an important crop in many countries. It is mainly used to obtain the castor oil, which is widely applied in various industries. The research aim was to study castor bean gene U6 promoters with help by bioinformatics and molecular genetic approaches. Zanzibar Green and Gibzonskaya varieties of castor bean plants were used in this work. DNA was isolated from young leaves. The preparation of sequences, alignments and homology level calculation were carried out by GenDoc program. Primers for amplification of castor bean U6 promoters were designed by Primer3 program. PCR was performed using a C-100 PCR machine (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). PCR products were separated in 1.5% agarose gel at 6 B/cm in the Sub-Cell GT electrophoresis camera (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). The amplicons were purified with the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The purified amplicons were cloned into the pAL2-T vector (Evrogen, Russia). In the CRISPR/Cas9 vector construction, the pRGE31, HindIII and SbfI restriction enzymes (Sibenzyme, Russia) and nucleotides were used. Purification of the digested products was carried out with the GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). Bioinformatic search were conducted in the GenBank base, and 12 scaffolds with the castor bean U6 gene were found. Six promoters with intact USE and TATA-box elements of regulation were used in the primer design for amplification with cv. Zanzibar Green and cv. Gibzonskaya DNA matrices. One fragment PCR products were cloned and sequenced. The analysis of the obtained amplicon sequences reveled that promoter regions of two studied varieties were similar. The level of promoter identity from different amplicons ranged within 51-77%. When comparing the same promoters with the U6 gene promoters of other plants the homology degree was 42-64%. The promoter sequences with intact USE and TATA-box motifs were used in construction of the CRISPR/Cas9 vectors.