Оптимизация метода ПЦР-диагностики вируса шарки сливы | Improvement of the PCR method for the diagnosis of the plum shark virus

English. Fruit crop virus has a negative effect on the timing of ripening and quality of fruit-bearing of plants. Virus free plants should be used for orchard set-up. Plum virus pox disease is a serious threat to horticulture because it has a wide range of host plants and able to spread in orchards in a short time. Methods for effective diagnosis of this virus are of high importance for the production of virus-free planting material. There are presented the results of testing and optimization of the method of plum virus pox disease diagnosis using reverse transcription PCR method, as well as the evaluation of its effectiveness in comparison with commercial kit using. Various tissues of PKSK 1, AI 1, VSL 1, and Gizela 5 rootstocks obtained in apical meristem culture and plum plants of Stanley cultivar ere used as the material. The concentration in the ratio of Oligo dT (Oligo(dT)15-primer) and Random (Random (dN)10-primer) primers added was optimized (1:2), in order to increase the yield of specific viral cDNA fragments. The primer pair of the amplification control was matched to the region of the gene encoding the small subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. For comparative evaluation, cDNA samples from plants obtained in vitro apical meristem culture and samples from symptomatic plants were used. After obtaining the preparation of total RNA, reverse transcription and amplification of the obtained cDNA were performed, followed by analysing the products on an agarose gel. No nonspecific amplification products and single-stranded DNA were observed in the samples. Amplification products of positive controls were observed in all samples examined. The studied method showed high efficiency compared to the standard method.

Russian. Вирус плодовых культур оказывает негативное влияние на сроки созревания и качество плодоношения растений. Для закладки садов необходимо использовать растения, свободные от вирусов. Вирус шарки сливы является серьёзной угрозой для садоводства, так как имеет широкий спектр растений – носителей и способен в короткие сроки распространяться в садовых насаждениях. Методы эффективной диагностики данного вируса имеют высокое значение для производства безвирусного посадочного материала. Представлены результаты апробации и оптимизации методики диагностики вируса шарки сливы с применением метода ПЦР с обратной транскрипцией, а также оценка его эффективности в сравнении с коммерческим набором. В качестве материала выступали различные ткани подвоев ПКСК 1, АИ 1, ВСЛ 1и Гизела 5, полученных в культуре апикальных меристем и растения сливы сорта Стенлей. Была оптимизирована концентрация в соотношении добавленных Oligo dT (Oligo(dT)15-primer) и Random (Random (dN)10–primer) праймеров (1:2), с целью увеличения выхода специфических фрагментов вирусной кДНК. Праймерная пара контроля амплификации подобрана к участку гена, кодирующего малую субъединицу рибулоза 1,5 – бисфосфат карбоксилазы/ оксигеназы. Для сравнительной оценки использовали пробы кДНК растений, полученных в культуре апикальных меристем in vitro и пробы симптомированных растений. После получения препарата тотальной РНК проводили обратную транскрипцию и амплификацию полученной кДНК с последующим анализом продуктов на агарозном геле. В образцах не наблюдались продукты неспецифической амплификации и одноцепочечной ДНК. Продукты амплификации положительного контроля наблюдались во всех исследованных образцах. Исследованный метод показал высокую эффективность в сравнении с контрольным.