Application of molecular methods for the identification of Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens and Clostridium sordellii isolated from cattle | Применение молекулярных методов для идентификации Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii, выделенных от крупного рогатого скота

English. An effective method of Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens and Clostridium sordellii species identification based on real-time polymerase chain reaction (PCR) has been under development. The applicability of the method for the clostridiosis diagnosis in cattle are assessed. A total of 90 samples of biological material collected from diseased animals in the farms of the Novosibirsk region in 2023 were studied by bacteriological and biochemical methods. The obtained results were confirmed by sequencing of PCR fragments of 16S rRNA gene. As a result of acteriological studies, culture-morphological and biohttps, chemical properties, 44 isolates of clostridia belonging to nine species were identified. Three primer and probe pairs were selected for the amplification of the gene fragments gerKA C. sporogenes, plc C. perfringens, and NanS C. sordellii. As a result of experimental studies, the working concentrations of primers and probes, providing the necessary sensitivity of the method, were determined and the conditions of PCR were optimized. Specificity of the selected oligonucleotides was tested using the strains of other species clostridia and bacteria of other species. The sensitivity of PCR was at least 10E2 CFU/mL for pure bacterial cultures and at least 10E5 CFU/mL for suspensions from biomaterial samples. Compared to direct examination of the biomaterial samples in mixed cultures of bacteria isolated from the same samples on nutrient media, the number of positive results was higher (53 and 37%, respectively). The developed method allows for faster and more effective diagnostics of bovine clostridiosis. The sensitivity of the developed method is higher when examining the bacterial cultures isolated on nutrient media than when directly examining biomaterial samples.

Russian. Разрабатывали эффективный метод видовой идентификации клостридий Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii на базе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, оценивали его применимость для диагностики клостридиозов крупного рогатого скота. Исследовали 90 проб биологического материала, отобранных от больных животных в хозяйствах Новосибирской области в 2023 г., которые изучали бактериологическим и биохимическим методами. Полученные результаты подтверждали секвенированием ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК. В результате бактериологических исследований, а также изучения культурально-морфологических и биохимических свойств идентифицировали 44 изолята клостридий, принадлежащих к 9 видам. Выбраны 3 пары праймеров и зондов для амплификации фрагментов генов gerKA C. sporogenes, plc C. perfringens и NanS C. sordellii. Определили рабочие концентрации праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность метода, оптимизировали условия проведения ПЦР. Специфичность выбранных олигонуклеотидов проверяли с использованием штаммов клостридий других видов и бактерий других видов. Чувствительность ПЦР составила при исследовании чистых культур бактерий не менее 10E2 КОЕ/мл, суспензий из проб биоматериала – не менее 10E5 КОЕ/мл. В сравнении с непосредственным исследованием проб биоматериала в смешанных культурах бактерий, выделенных из этих же проб на питательных средах, количество положительных результатов было выше (53 и 37% соответственно). Разработанный метод позволяет диагностировать клостридиозы крупного рогатого скота быстрее и эффективнее. Чувствительность метода выше при исследовании бактериальных культур, выделенных на питательных средах, чем при непосредственном исследовании проб биоматериала.