Mise au point d' une methode de diagnostic rapide et fiable de la loque americane (Paenibacillus larvae subsp.) a l' aide de la PCR basee sur le gene 16S de l' ARNr.

French. Paenibacillus larvae larvae est une bacterie difficile a croissance lente qui est a l' origine de la loque americaine (AFB), maladie essentielle des abeilles. Son isolement et son identification probable peuvent etre difficiles et prendre du temps. C' est pourquoi on s' est attache dans cette etude a mettre au point et evaluer une diagnose rapide de l' AFB par la PCR (reaction en chaine de la polymerase). De nouvelles amorces de PCR ont ete mises au point d' apres l' alignement de plusieurs sequences du gene 16S de l' ARNr de diverses bacteries apparentees avec la sequence du meme gene de P. l. larvae (no. X60619 de la Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). L' ADN a ete isole au moyen d' un kit d' isolement d' ADN Puregene ou d' une methode simple comprenant chauffage et centrifugation. Pour echantillonner directement le couvain, une suspension de restes larvaires a ete faite dans 1 mL d' H2O et diluee 10 fois avant d' extraire l' ADN par la methode simple. On a trouve deux nouvelles amorces et, avec les deux amorces precedemment decrites, on disposait de quatre combinaisons d' amorces possibles pour la PCR. Dans les conditions de la PCR decrites, les quatre combinaisons d' amorces ont donne le produit de PCR attendu. Des reactions croisees ont ete testees chez un grand nombre d' especes proches ou d' especes que l' on trouve dans la ruche. La PCR n' a donne des produits d' amplification qu' avec P. l. pulvifaciens. Ils avaient la meme longueur que ceux generes avec P. l. larvae. Ce n' est pas surprenant puisque les deux bacteries appartiennent a la meme espece. En outre la technique ARDRA, basee sur le meme gene, a montre plus de 90 / de similitude entre les deux especes (Heyndrickx et al., 1996) et n' a pu separer clairement les deux bacteries. Pour tester la possibilite d' une PCR avec l' ADN extrait directement des larves malades, 141 echantillons de couvain, sur lesquels on avait recherche auparavant l' AFB, ont ete testes. Un produit d' amplification de PCR a ete genere avec chaque echantillon atteint d' AFB, aucun n' a ete genere avec les echantillons sains. Les echantillons qui avaient quelques spores mais ne presentaient pas de signes cliniques n' ont pas donne non plus de produits d' amplification. Ceci est probablement du au fait que la methode utilisee pour isoler l' ADN ne peut pas extraire l' ADN des spores. Cette hypothese est confirmee par le fait qu' aucun produit d' amplification n' a ete genere directement a partir d' echantillons de miel contenant P. l. larvae. Il est tres vraisemblable que seules les spores, et non les cellules vegetatives, sont presentes dans le miel en raison du caractere antibacterien de celui-ci. Les restes de larves tuees par l' AFB contiennent elles aussi un grand nombre de spores, mais egalement quelques cellules vegetatives de la bacterie et ces dernieres permettent l' identification par la PCR. Cette diagnose s' est montree fiable et rapide et fournit une alternative precieuse aux diagnoses plus classiques basees sur l' isolation et l' identification biochimique de P.larvae.