Formación de biofilms por cepas Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC) y Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) sobre distintas superficies, sometidas a distintas condiciones de estrés

Los biofilms son definidos como comunidades complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz extracelular producida por las propias células y adherida a una superficie viva o inerte, que presentan un fenotipo alterado comparado al de sus contrapartes planctónicas respecto de la tasa de crecimiento y la transcripción genética, y que pueden estar compuestos por una única especie microbiana (mono-especie) o por varias especies diferentes (multi-especie). Uno de los principales problemas para la industria y la salud pública está representado por la supervivencia y la capacidad de formar biofilms de microorganismos patógenos o alterantes sobre las superficies, utensilios y equipos en contacto con los alimentos y sobre dispositivos de uso médico como catéteres, prótesis, entre otros. Los biofilms les permiten a las bacterias colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes y resistir a condiciones adversas del ambiente que constituyen factores de estrés como por ejemplo, la manipulación, higiene, conservación y composición de materiales y alimentos. En la industria alimentaria los biofilms pueden formarse en superficie tales como plástico, cristal, madera, acero inoxidable y sobre los alimentos. Una desinfección insuficiente o inadecuada de las superficies o de los instrumentos en contacto con los alimentos, provoca un incremento en la contaminación del producto y el desarrollo de toxiinfecciones alimentarias. La formación de biofilms desarrollada mediante estudios in vitro, se ve influenciada por muchos factores, como por ejemplo, el medio de cultivo (composición de nutrientes, temperatura, pH), el inóculo (el microorganismo que se estudia, número de células), la hidrodinámica (sistemas de flujo continuo vs. cultivo estático) y la superficie (rugosidad, carga superficial). De la combinación de estos factores dependerán en gran medida los resultados que se obtengan, e incluso podrían llegar a variar aun utilizando el mismo microorganismo. Dentro de los microorganismos que pueden formar biofilm se encuentra Escherichia coli verotoxigénica (VTEC) y enteropatogénica (EPEC). VTEC es un patógeno emergente relacionado con la Salud Pública que puede causar enfermedades graves en humanos como colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH). El principal reservorio es el bovino, pudiéndose transmitir al humano por medio de alimentos derivados, el contacto con los animales o su ambiente. EPEC son cepas diarreagénicas de E. coli que producen en las células intestinales lesiones histopatológicas de "adherencia y borrado" (A/E) del enterocito y que no producen toxinas tipo Shiga. Al igual que otras E. coli diarreagénicas, se transmite por vía fecal- oral a través de manos, agua y alimentos contaminados y su principal reservorio es el humano, especialmente los niños con diarrea y niños o adultos portadores asintomáticos. VTEC y EPEC poseen factores putativos de virulencia codificados en plásmidos y factores de adherencia que le permiten la adherencia y la colonización tanto de tejidos vivos como de superficies inertes, con la posibilidad de formar biofilms y persistir en el ambiente donde se encuentran. Este trabajo de Tesis tuvo como objetivo principal determinar la capacidad de formar biofilms de cepas VTEC y EPEC atípica sobre dos superficies inertes que pueden estar presentes en la industria alimentaria y el ambiente doméstico (poliestireno y acero inoxidable) y evaluar los efectos que producen distintas condiciones de estrés sobre el desarrollo de los biofilms. Además, se estudió la presencia de genes que codifican para adhesinas involucradas en la formación de biofilms y otros factores de virulencia. Los aislamientos estudiados presentaron una gran variedad de perfiles genéticos que las hacen potencialmente patógenas para el ser humano ya que varios de estos genes están implicados en daños a nivel celular o molecular en el huésped. Se pudo establecer una asociación entre la categoría del animal y los sistemas de producción, con los serotipos y la presencia/ausencia de distintos genes putativos de virulencia del megaplásmido y adhesinas implicados en la colonización del bovino. Los genes que codifican para fimbrias y factores de adherencia implicados en la formación de biofilm, como fimCD y agn43, fueron encontrados tanto en VTEC como en aEPEC, los cuales otorgarían a ambos grupos la posibilidad de formar biofilm en ambientes con diversidad de nutrientes. En las cepas VTEC provenientes de casos clínicos se detectaron la mayoría de los genes implicados en la adherencia y la formación de biofilm, siendo lpf uno de los genes que más variación mostró según el serotipo (O157:H7 o no-O157). En esta Tesis se pudo evaluar también, la expresión de la fimbria curli bajo distintas condiciones de cultivo y en distintas etapas de la formación de biofilm. Se obtuvieron resultados evidentes en cuanto a la expresión de la fimbria curli vinculada a la temperatura y los tiempos de incubación. Es así que las cepas presentaron fenotipos curli positivos a temperatura cercanas a los 20 °C y con más de 48 h de incubación; sin embargo, la formación de biofilm en esas condiciones era generalmente menor a la obtenida a 37 °C. Con respecto a la formación de biofilm en distintas condiciones de cultivo y superficies, los resultados obtenidos permitieron demostrar que todas las cepas analizadas fueron formadoras de biofilm (moderadas o fuertes) en condiciones estándares de cultivo, a 37 °C sobre poliestireno. La variable de estrés que mayor afectó el desarrollo de biofilms sobre dicha superficie fue la temperatura. Las condiciones del medio de cultivo afectaron en mayor medida la formación de biofilm sobre la superficie de acero inoxidable provocando que las cepas sean débiles formadoras o no formen biofilm. Tanto VTEC como aEPEC fueron fuertes formadoras de biofilm sobre superficie de poliestireno, y no se encontraron diferencias significativas entre las distintas condiciones del medio (estándar, acídico y alcohólico). En la mayoría de los casos, aEPEC fue mayor formadora de biofilm que VTEC y, dentro de VTEC, las cepas eae- fueron mejores formadoras de biofilms que cepas eae+. Esto resalta la importancia de tener en cuenta otros patotipos de E. coli y serotipos VTEC eae- a la hora de diagramar buenas prácticas de manufactura e higiene y técnicas de diagnóstico para la industria de los alimentos. La simulación de condiciones que pueden ser encontradas en la industria alimentaria (medio, superficie, temperatura) en el trabajo de Laboratorio, resulta una herramienta útil y valiosa para conocer el comportamiento de los microorganismos que puedan transmitirse por alimentos y ser perjudiciales para la salud en humanos.

Biofilms are defined as complex communities of microorganisms that grow embedded in an extracellular matrix produced by cell themselves. They are adhered to biotic or abiotic surfaces and exhibit an altered phenotype compared to their planktonic counterparts regarding the growth rate and transcription genetic. Biofilms may be composed of a single microbial species (mono-species) or a several different species (multi-species). One of the main problems for industry and public health is the survival and the ability to form biofilms by pathogenic or altering microorganisms on surfaces, utensils and equipment in contact with food and on medical devices such as catheters, prostheses, among others. Biofilms allow bacteria to colonize a large number and diversity of environments and resist adverse environmental conditions that constitute stress factors such as handling, hygiene, conservation and composition of materials and food. In the food industry biofilms can be formed on surfaces such as plastic, glass, wood, stainless steel and on food. Insufficient or inadequate disinfection of surfaces or instruments in contact with food causes an increase in product contamination and the development of food poisoning. The biofilm formation developed by in vitro studies is influenced by many factors, for example, the culture medium (nutrient composition, temperature, pH), the inoculum (the microorganism being studied, number of cells), the hydrodynamics (continuous flow systems vs. static culture) and the surface (roughness, surface charge). The results obtained will depend of the combination of these factors, and may even vary using the same microorganism. Verotoxigenic (VTEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli are microorganisms that can form biofilms. VTEC is an emerging pathogen related to public health that cause serious diseases in humans, such as hemorrhagic colitis (CH) and hemolytic uremic syndrome (HUS). The main reservoir of VTEC is cattle, being able to transmit it to humans through derived foods, contact with the animals or their environment. EPEC are diarrheagenic strains of E. coli that produce in the intestinal cells histopathological lesions of "attaching and effacement" (A/E) of the enterocyte, and that do not produce Shiga toxins. Like other diarrheagenic E. coli, it is transmitted by via fecal-oral route, through contaminated hands, water and food. The main reservoir of EPEC is the human, especially children with diarrhea or asymptomatic carriers. VTEC and EPEC have putative virulence factors encoded in plasmids and adhesion factors that allow adherence and colonization of both living tissues and inert surfaces, with the possibility of forming biofilms and persisting in the environment where they are found. The main objective of this Thesis was to determine the capacity to form biofilms of VTEC and atypical EPEC strains on two inert surfaces that may be present in the food industry and the domestic environment (polystyrene and stainless steel) and to evaluate the effects produced by different stress conditions on the development of biofilms. In addition, the presence of genes coding for adhesins involved in the biofilm formation and other virulence factors was studied. The isolates presented several genetic profiles that make them potentially pathogenic for human since several of these genes are involved in damages at cellular or molecular level in the host. An association between the category of the animal and production systems, with the serotypes and the presence/absence of different putative virulence genes of megaplasmid and adhesins involved in the colonization of cattle could be established. Genes coding for fimbriae and adhesion factors involved in the biofilm formation, such as fimCD and agn43, were found in both VTEC and aEPEC, which would give to both groups the possibility to form biofilms in environments with nutrient diversity. In VTEC strains isolated from clinical cases, most of the genes involved in adhesion and biofilm formation were detected, being lpf one of the genes that showed more variation according to the serotype (O157:H7 or not-O157). In this Thesis we also evaluated the expression of the curli fimbria under different culture conditions and at different stages of biofilm formation. The results were conclusive regarding to the expression of curli fimbria linked to the temperature and incubation times. Thus, the strains showed curli positive phenotypes at temperatures close to 20 °C and with more than 48 h of incubation. However, biofilm formation in those conditions was generally lower than that obtained at 37 °C. Regarding the formation of biofilm in different culture conditions and surfaces, the results allowed to demonstrate that all strains analyzed were biofilm formers (moderate or strong) under standard culture conditions, at 37 °C on polystyrene. Temperature was the stress variable that most affected the development of biofilms on polystyrene surface, but culture medium conditions mainly affected the biofilm formation on the stainless steel surface, being the strains weak forming or not forming biofilm. Both VTEC and aEPEC were strong biofilm formers on polystyrene surface, and no significant differences were found between the biofilm formation under different conditions of the medium (standard, acidic and alcoholic). In most cases, aEPEC formed more biofilm than VTEC and among VTEC strains, eae- strains were better biofilm formers than eae+. This highlights the importance of taking into account other E. coli pathotypes and VTEC eae- serotypes to diagram good manufacturing and hygiene practices and diagnostic techniques for the food industry. The simulation of conditions that can be found in the food industry in the laboratory work is a useful and valuable tool to know the behavior of microorganisms that can be transmitted by food and be damaging to human health.

Fil: Cáceres, María Emilia. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina