Estudo do potencial antimicrobiano de espécies de Aspergillus e Penicillium isoladas do bioma amazônico

Programa de Doutorado em Ciências - Cooperação entre o Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e o Instituto de Pesquisa Leônidas e Maria Deane (ILMD)

Considerando a necessidade de novas pesquisas sobre a busca de biomoléculas bioativas e a possibilidade da obtenção de novos bioprodutos oriundos de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium muito comuns nos ecossistemas terrestres da Amazônia, esta pesquisa teve como objetivo investigar a produção de metabólitos ativos obtidos em espécies de Aspergillus e Penicillium do acervo da Coleção de Fungos da Amazônia-CFAM para obtenção de compostos antimicrobiano de interesse para saúde. Para alcançar esse objetivo, 100 culturas fúngicas preservadas em água destilada foram reativadas em ágar extrato de malte e mantidas a 28 oC por 7 dias, em estufa. As colônias que mostraram viabilidade foram transferidas para o meio de cultura YES [ágar extrato de levedura 2% (p/v) e sacarose 20% (p/v)] para crescimento e extração a frio em acetato de etila (AcOEt) dos metabólitos secundários. Os extratos obtidos foram avaliados quanto à atividade antimicrobiana frente a Candida albicans, bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus MRSA e Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli), pela técnica de difusão em ágar por poço, e a determinação da concentração inibitória mínima-CIM, foi realizada pelo método de microdiluição em caldo. Os extratos orgânicos que inibiram os microrganismos-teste na menor concentração bactericida/fungicida foram fracionados por cromatografia de coluna aberta e preparativa. As frações ativas foram purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e tiveram os seus constituintes químicos identificados por ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massas (EM). A molécula isolada de Aspergillus pseudonomius foi avaliada quanto à citotoxicidade frente a linhagem de fibroblasto humano (MRC5) e a avaliação da atividade antimicrobiana foi investigada pelo método de microdiluição em caldo. Quanto aos resultados obtidos observou-se que dentre os 100 extratos fúngicos avaliados por difusão em ágar por poço, 64% apresentaram atividade inibitória frente a pelo menos um microrganismo testado, com CIM variando de 1000 a 15,6 μg/mL. Com base na CIM, foram selecionados os extratos de A. pseudonomius CFAM 0143 e Aspergillus oryzae CFAM 0391 para prospecção química. Nas frações obtidas desses extratos, os ensaios da CCD sugeriram a presença de grupos de ligações duplas, cumarinas, flavonoides, terpenos, substâncias fenólicas e nitrogenadas, alcalóides contendo anéis aromáticos. A partir do fracionamento do extrato AcOEt de A. pseudonomius e A. oryzae, foi isolado o ácido kójico [5-hidroxi-2-(hidroximetil)]-4-pirona, que mostrou viabilidade celular de MRC5 de 500 a 7,81 μg/mL, apresentando moderada toxicidade nas concentrações testadas, indicando que a molécula isolada apresenta baixo riscos à saúde do homem e outros animais. Apesar da atividade antimicrobiana do ácido kójico frente a Gram-positivas e Gram-negativa já ser conhecida, o ácido kójico isolado nesse trabalho de A. pseudonomius, nas concentrações de 1.000 μg/mL a 15,6 μg/mL, não inibiu o crescimento de S. aures CBAM 0324, S. aureus MRSA e E. coli CBAM 0002. Dessa forma, os resultados desse estudo contribuem com o conhecimento do potencial antimicrobiano dos gêneros Aspergillus e Penicillium do bioma amazônico frente a microrganismos patogênicos de importância para saúde, bem como com o conhecimento da diversidade das classes químicas das moléculas produzidas por eles. O isolamento do ácido kójico a partir de A. pseudonomius isolado do bioma amazônico é um resultado inédito, de acordo com o levantamento bibliográfico realizado. Esse resultado apoia e transforma a potencialidade de fungos presentes na região em fato científico, demonstrando que podem ser fontes alternativas para produção de substâncias estratégicas no setor industrial

Considering the need for further research on the search for bioactive biomolecules and the possibility of obtaining new bioproducts from fungi of the genus Aspergillus and Penicillium, which are very common in terrestrial ecosystems in the Amazon, this research aimed to investigate the production of active metabolites obtained in species of Aspergillus and Penicillium from the Amazonian Fungi Collection-CFAM to obtain compounds of health interest. To achieve this goal, 100 fungal cultures preserved in distilled water were reactivated on malt extract agar and kept at 28 oC for 7 days in an incubator. Colonies that showed viability were transferred to YES [2% (p/v) yeast extract agar and 20% (p/v) sucrose for growth and cold extraction in ethyl acetate (AcOEt) of secondary metabolites. The extracts obtained were evaluated for antimicrobial activity against Candida albicans, Gram-positive and negative bacteria, by the agar diffusion technique per well, and the determination of the Minimum Inhibitory Concentration-MIC was performed by the broth microdilution method. The organic extracts that inhibited the test microorganisms at the lowest bactericidal/fungicide concentration were fractionated by open and preparative column chromatography. The active fractions were purified by HPLC and had their chemical constituents identified by nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS). The identified molecule was evaluated for cytotoxicity against the human fibroblast lineage (MRC5). Among the fungal extracts evaluated by diffusion in agar per well, 64% showed inhibitory activity against at least one microorganism tested with MIC varying in different concentrations (1000 to 15.6 μg/mL). Based on the result of the MIC test, extracts of: Aspergillus pseudonomius CFAM 0143 and Aspergillus oryzae CFAM 0391 were selected for chemical prospecting. In the fractions obtained from these extracts, the CCD assays suggested the presence of groups of double bonds, coumarins, flavonoids, terpenes, phenolic and nitrogenous substances, alkaloids containing aromatic rings. From the fractionation of the AcOEt extract of A. pseudonomius and A. oryzae, kojic acid [5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)]-4-pyrone was isolated, which showed satisfactory cell viability of MRC5 at concentrations from 500 to 7,81 μg/mL, showing moderate toxicity at the concentrations tested, indicating that the isolated molecule does not pose risks to the health of humans and other animals. Thus, the results of this study contribute to the knowledge of the antimicrobial potential of the genus Aspergillus and Penicillium of the Amazon biome against pathogenic microorganisms of health importance, as well as to the knowledge of the diversity of chemical classes of the molecules produced by them. The isolation of kojic acid from Amazonian fungi in this work is an unprecedented result, according to the bibliographic survey carried out. This result reinforces the potential of fungi present in the region, demonstrating that they can be viable alternative sources for the production of strategic substances for the industrial sector

2121-01-31