Variaciones de tres protocolos de limpieza de Fitoplancton (Phylum: Heterokontophyta) y registro fotográfico con MEB

Los organismos fitoplanctónicos son componentes esenciales de las comunidades acuáticas, desempeñando un papel crucial al establecer la base de las redes tróficas en aguas costeras y oceánicas (Gaxiola-Castro et al., 2010). Su capacidad para convertir el dióxido de carbono (CO2) en carbono orgánico, es fundamental para sostener los niveles tróficos superiores en estos ecosistemas (Oliva-Martínez et al., 2014). En este conjunto destacan los phylums Heterokontophyta, al cual pertenecen las diatomeas y Dinoflagellata, donde se clasifican los dinoflagelados. Esto, debido a su gran abundancia y diversidad en ambientes marinos (Gómez, 2005). Estos dos grupos presentan características distintivas que son fundamentales para su identificación taxonómica (Ferrario et al., 1995; Vargas-Montero y Freer, 2004). La adecuada identificación de las especies es esencial para determinar la diversidad y composición de la comunidad fitoplanctónica en áreas geográficas determinadas (Castillo et al., 1988; Meave del Castillo et al., 2012). Sin embargo, es posible cometer errores debido al exceso de materia orgánica (MO), que, según Verdugo (1997), comprende partículas de tamaño superior a 5 μm, como detritus, bacterias, zooplancton y fitoplancton (o partes de estos). Verdugo-Díaz y Martínez-López, (2011) proponen clasificarla en dos categorias: material organico particulado de origen fitoplanctónico (MOPF) y no fitoplanctónico (MOPNF). Este estudio se centró en la MOPNF, ya que obstruye la observación de los organismos, así como de las estructuras y ornamentaciones fundamentales para la identificación. Lo anterior ha motivado el desarrollo de diversos métodos para reducir este material mediante procesos de oxidación (Ferrario et al., 1995), algunos de los cuales involucran el uso de ácidos fuertes, como el nítrico (HNO3), sulfúrico (H2SO4) y clorhídrico (HCl), mientras que otros emplean técnicas menos agresivas que incluyen acetona (C3H6O), pancreatina y permanganato de potasio (KMnO4). Estos procedimientos pueden variar en las concentraciones y combinaciones de los reactivos utilizados, así como en la aplicación de radiación ultravioleta (UV), calentamiento, enfriamiento, centrifugación o adición de otros compuestos como el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Balbuena-Chavez y Hernández-Becerril, 2016). Muchas de estas técnicas están documentadas en la literatura desde la década de los 50, como se puede observar en Werff (1953), Desikachary (1954), Helmcke (1954), Reimann (1960), Balech y Ferrando (1964), Hendey (1964), Simonsen (1974), Hasle y Syvertsen (1980), Hasle et al. (1983), Abrantes (1988), entre otros, lo que refleja el interés continuo de la comunidad científica en lograr identificaciones precisas de estos microorganismos. A pesar de la variedad de métodos disponibles, los procedimientos que utilizan ácidos tienden a romper o desintegrar en mayor proporción las células atecadas o débilmente silicificadas, en comparación a los organismos tecados o fuertemente silicificados, mientras que los enfoques considerados menos agresivos a menudo no eliminan suficiente MOPNF (Ferrario et al., 1995). El propósito de estos procedimientos además de la limpieza es preparar las muestras para métodos de análisis como la microscopía electrónica de barrido (MEB). Esta técnica tiene una capacidad de magnificación que permite analizar organismos y características morfológicas de tamaños reducidos porque alcanza hasta 1’000.000 X de aumento (Ferrario et al., 1995; Hernández et al., 2019), resultando útil para examinar con detalle las células fitoplanctónicas, independientemente de los rangos de tamaño que pueden encontrarse en diferentes áreas geográficas, los cuales pueden variar entre 0,2 a 200 µm. Considerando los desafíos en la identificación debido a la presencia de MOPNF y a las múltiples metodologías para su oxidación, el objetivo del presente estudio planteó optimizar los protocolos de limpieza que involucran ácido nítrico (HNO3), ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2), con el propósito de maximizar la eliminación de MOPNF en las muestras de fitoplancton y observar las ornamentaciones celulares que permitan la identificación a nivel de género y/o especie, empleando la técnica de MEB. Este trabajo se encuentra enmarcado en el Proyecto de Biodiversidad y Condiciones Oceanográficas del estrecho de Gerlache-Fase II del Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras José Benito Vives de Andréis INVEMAR y la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano desarrollado por el grupo de Investigación Dinámica y Manejo de Ecosistemas Marino-Costeros-DIMARCO (Grupo A1 del Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación) en la línea de investigación de oceanografía física, química y biológica.

Phytoplanktonic organisms are essential components of aquatic communities, playing a crucial role in establishing the base of trophic webs in coastal and oceanic waters (Gaxiola-Castro et al., 2010). Their ability to convert carbon dioxide (CO2) into organic carbon is fundamental for supporting higher trophic levels in these ecosystems (Oliva-Martínez et al., 2014). Noteworthy among these organisms are the phyla Heterokontophyta, which include diatoms, and Dinoflagellata, which include dinoflagellates, due to their great abundance and diversity in marine environments (Gómez, 2005). These two groups present distinctive characteristics that are fundamental for their taxonomic identification (Ferrario et al., 1995; Vargas-Montero and Freer, 2004). Proper species identification is essential for determining the diversity and composition of the phytoplankton community in specific geographic areas (Castillo et al., 1988; Meave del Castillo et al., 2012). However, errors can occur due to the presence of excess organic matter (OM), which, according to Verdugo (1997), includes particles larger than 5 μm, such as detritus, bacteria, zooplankton, and phytoplankton (or parts thereof). Verdugo-Díaz and Martínez-López (2011) propose classifying it into two categories: phytoplankton-derived particulate organic matter (POMp) and non-phytoplankton-derived particulate organic matter (POMnp). This study focused on POMnp, as it obstructs the observation of organisms and the structures and ornamentations essential for identification. This has motivated the development of various methods to reduce this material through oxidation processes (Ferrario et al., 1995), some of which involve the use of strong acids, such as nitric (HNO3), sulfuric (H2SO4), and hydrochloric (HCl), while others use less aggressive techniques, including acetone (C3H6O), pancreatin, and potassium permanganate (KMnO4). These procedures can vary in the concentrations and combinations of reagents used, as well as in the application of ultraviolet (UV) radiation, heating, cooling, centrifugation, or the addition of other compounds such as hydrogen peroxide (H2O2) (Balbuena-Chavez and Hernández-Becerril, 2016). Many of these techniques have been documented in the literature since the 1950s, as seen in Werff (1953), Desikachary (1954), Helmcke (1954), Reimann (1960), Balech and Ferrando (1964), Hendey (1964), Simonsen (1974), Hasle and Syvertsen (1980), Hasle et al. (1983), Abrantes (1988), among others, reflecting the continuous interest of the scientific community in achieving precise identifications of these microorganisms. Despite the variety of available methods, procedures using acids tend to break or disintegrate non-armored or weakly silicified cells to a greater extent than armored or strongly silicified organisms, while less aggressive approaches often do not sufficiently remove POMnp (Ferrario et al., 1995). The purpose of these procedures, in addition to cleaning, is to prepare samples for analysis methods such as scanning electron microscopy (SEM). This technique has magnification capabilities that allow for the analysis of organisms and morphological characteristics of small sizes because it reaches up to 1,000,000 X magnification (Ferrario et al., 1995; Hernández et al., 2019), making it useful for examining phytoplankton cells in detail, regardless of the size ranges found in different geographic areas, which can vary between 0.2 to 200 µm. Considering the challenges in identification due to the presence of POMnp and the various methodologies for its oxidation, the objective of this study was to optimize cleaning protocols involving nitric acid (HNO3), sulfuric acid (H2SO4), and hydrogen peroxide (H2O2), to maximize the removal of POMnp in phytoplankton samples and observe cellular ornamentations that allow identification at the genus and/or species level, using the SEM technique. This work is framed within the Biodiversity and Oceanographic Conditions Project of the Gerlache Strait-Phase II of the Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras José Benito Vives de Andréis INVEMAR and the Jorge Tadeo Lozano University of Bogotá, developed by the Marine-Coastal Ecosystems Dynamics and Management Research Group-DIMARCO (Group A1 of the Ministry of Science, Technology, and Innovation) in the research line of physical, chemical, and biological oceanography.