Inmunidad Innata frente a lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV)

[ES] En esta tesis se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Identificación y caracterización de la restricción por APOBEC3 ovino frente a los SRLV. Se han estudiado dos tipos celulares que muestran restricción natural frente a los SRLV, monocitos y macrófagos-M1, identificando la isoforma Z1 como la más expresada, entre las proteínas APOBEC3 ovinas. En la caracterización genética de A3Z1 se ha identificado una isoforma adicional resultante de splicing alternativo, también presente en el transcriptoma humano y que carece del dominio citidín desaminasa (A3Z1Tr) característico de este tipo de proteínas. La expresión de estas proteínas se induce tanto tras la incubación con IFN-ɣ como con la infección viral. Ambas son resistentes a la degradación por Vif de SRLV y pueden encapsidarse en los viriones. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido determinar que ambas proteínas pueden interactuar entre sí así como con Vif viral, a pesar de la resistencia que presentan a su degradación. La expresión endógena de A3Z1 en células en cultivo tipo fibroblasto (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) tan solo ha sido posible empleando estrategias de expresión transitoria, ya que los intentos de expresión permanente resultaban en cultivos abortivos. Las células TIGEF que expresan A3Z1 muestran una menor producción de SRLV. Ensayos de infectividad de un solo ciclo (single cycle infection) con vectores virales basados en HIV-1, MLV y SIV indican que A3Z1 ovino es capaz de inhibir la infectividad de dichos vectores. El mecanismo de restricción parece implicar la actividad citidín desaminasa en el contexto GA/AA. En ambos casos, la co-expresión de la isoforma truncada mitiga la restricción, probablemente por competición estérica con la proteína nativa en el interior de los viriones. 2. Caracterización de las vías de degradación de APOBEC3. Se ha investigado la capacidad de A3Z1 de restringir la infección con estirpes de SRLV que codifican la proteína Vif. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido comprobar que CYPA y no CBF-β es el cofactor necesario para la degradación de las proteínas APOBEC3 ovinas, requisito esencial en el caso de A3Z1 y A3Z1Tr. Concentraciones altas de CYPA permiten la degradación de A3Z1 por parte de Vif en diferentes tipos celulares, promoviendo así la infección por lentivirus. Sin embargo, no se alcanzan los niveles basales de A3Z1 empleando inhibidores del proteasoma y la degradación se produce también en presencia de Vif mutado, incapaz de reclutar el complejo ubiquitín ligasa y degradar así proteínas por la vía proteasomal, abriendo la posibilidad a la existencia de vías alternativas que permitan degradar A3Z1. Tan solo la combinación de inhibidores del proteasoma junto con inhibidores de la autofagia conseguían restablecer los niveles basales de A3Z1 sugiriendo la implicación de ambas vías. Además, la inhibición de la autofagia parece perjudicar la infección por SRLV, sugiriendo que la inducción podría favorecerla.

[EN] Different studies have been carried out in this thesis: 1. Identification and characterization of the restriction exerted by ovine APOBEC3 against SRLV. Two cellular types that show natural restriction against SRLV have been studied, monocytes and M1-macrophages, identifying the Z1 isoform as the most expressed, among the ovine APOBEC3 proteins. In the genetic characterization of A3Z1, an additional isoform resulting from alternative splicing, also present in the human transcriptome, was described. This new isoform lacks the citidin deaminase domain (A3Z1Tr), characteristic of this type of proteins. Both A3Z1 proteins were induced after incubation with IFN-γ as well as after viral infection, are resistant to Vif SRLV degradation and can be incorporated into virions. Through immunoprecipitation assays we have been able to determine that both A3Z1 proteins can interact, as well as with viral Vif, in spite of their resistance to degradation. A3Z1 endogenous expression in fibroblast type cells (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) has only been possible using transient expression strategies, because permanent expression experiments resulted in aborted cultures. TIGEF cells that transiently express A3Z1 show a lower SRLV production. Single cycle infectivity trials with viral vectors based on HIV-1, MLV and SIV showed that ovine A3Z1 is able to inhibit the aforementioned vectors. The restriction mechanism seem to be citidin deaminase dependent in the GA/AA context. In both cases, the co-expression of the truncated isoform mitigates the restriction, probably by steric competition with the native protein inside the virions. 2. Characterization of APOBEC3 degradation pathways. The ability of A3Z1 to restrict SRLVs encoding the Vif protein has been investigated. Through immunoprecipitation assays it has been possible to confirm that CYPA, and not CBF-β is the cofactor for the optimal degradation of ovine APOBEC3, an essential requirement in the case of A3Z1 and A3Z1Tr. High concentrations of CYPA allowed the degradation of A3Z1 by Vif in different cell types, thus promoting lentivirus infection. However, A3Z1 basal levels were not restored when proteasome inhibitors were used. Furthermore, degradation also happened in the presence of a mutated Vif, unable to recruit the ubiquitin ligase complex and degrade proteins by the proteasome pathway, opening alternative pathways to degrade A3Z1. The combination of proteasome and autophagy inhibitors was able to restore A3Z1 basal levels, suggesting the involvement of both pathways. In addition, autophagy inhibition seems to impair SRLV infection, suggesting that induction could be a virus promoting mechanism.

Este trabajo ha sido financiado por los siguientes proyectos de investigación: Título del proyecto: 'Inmunidad innata y adquirida frente a lentivirus de pequeños rumiantes: elementos responsables del tropismo viral y de la presentación clínica de la enfermedad'. Entidad financiadora: CICYT (AGL2010-22341-C04-01); Título del proyecto: 'Patogenómica traslacional en el estudio de enfermedades infecciosas con implicaciones económico-sanitarias en especies productivas'. Entidad financiadora: Gobierno de Navarra (referencia IIQ14064.RI1); Título del proyecto: 'Modelos in vitro para evaluación de eficacia inmunológica de β-glucanos de Shiitake'. Entidad financiadora: Agencia de Desarrollo Económico de La Rioja, ADER (en colaboración con UE: FEDER, FEADER) (Ref.: 2013-l-lDD-00074); Título del proyecto: 'Inmunidad implicada en los procesos inmunomediados: síndrome asia ovino y lentivirosis de especies productivas'. Entidad financiadora: MINECO_DGICYT (AGL2013-49137-C3-1-R); Título del proyecto: 'Potenciación del estado inmunológico del ganado cunícula a través de betaglucanos de setas (RABBITGLUCAN)'. Entidad financiadora: CENTRO PARA EL DESARROLLO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL (CDTI) (cofinanciable con FEDER) (Ref.: IDI 20140852); Título del proyecto: 'Inmunopotenciación del ganado cunícula mediante suplementos a base de beta glucanos de setas (CUNIGLUCAN)'. Entidad financiadora: MAGRAMA Ayudas IDi (REF.: 20140020001815); Título del proyecto: 'Nuevas estrategias de control frente a lentivirus basadas en terapia génica'. Entidad financiadora: Fundación Caja Navarra Id70558; Título del proyecto: 'Contribución a la epidemiologia molecular y al control innato de las infecciones lentivirales ovi-caprinas'. Entidad financiadora: Gobierno de Navarra. Departamento de Desarrollo Económico PI042 LENTIMOL; Título del proyecto: 'Epidemiología molecular y control innato de las infecciones lentivirales en el ganado Navarro'. Entidad financiadora: Gobierno de Navarra. Plan de Desarrollo Rural; Título del proyecto: 'Herramientas diagnósticas y adyuvantes inmunológicos para el control del Ectima contagioso en Navarra. (CONECTIM)'. Entidad financiadora: Gobierno de Navarra. Centros Tecnológicos.