Standardization of PCR and sequencing-based methods for the detection of the presence of CP4 EPSPS gene in Zea mays | Padronização de método baseado em PCR e sequenciamento para detecção da presença do gene CP4 EPSPS em Zea mays

English. With the rise in planting of transgenic cultivars in Brazil as well as worldwide, the demand for legal regulations has increased. The transgenic event MON88017 is often found in maize cultivars marketed in Brazil. The event contains the CP4 EPSPS and cry3Bb1 genes, which encode tolerance to the herbicide glyphosate and resistance to caterpillars, respectively. Globally, methodologies to track transgenic events are mandatory. The objective of this study was to standardize a method based on qualitative PCR and sequencing for detection of the CP4 EPSPS gene in Zea mays. DNA was extracted from three commercial strains of transgenic maize, containing the MON88017 event, as well as conventional maize. Primers were designed for partial detection of the zein and CP4 EPSPS genes. PCR reactions were performed for detection of partial regions of CP4 EPSPS and Zein (as endogenous marker of Z. mays) genes. The three transgenic maize inbred lines tested positive for zein and CP4 EPSPS, and the two conventional strains tested negative for CP4 EPSPS and positive for the Zein gene. To confirm the presence of the genic regions, PCR products were sequenced and showed 100% identity with sequences of Zein and CP4 EPSPS genes deposited in GenBank. Thus, the results of this study suggest the applicability of an ‘in-house’ method for the qualitative detection of CP4 EPSPS in genetically modified maize cultivars.

Portuguese. O plantio de cultivares transgênicas no Brasil e no mundo tem crescido e demandado regulamentação legal. O evento transgênico MON8807 é frequentemente encontrado em cultivares de milho comercializadas no Brasil. Esse evento contém em sua construção os genes CP4 EPSPS e Cry3Bb1 que codificam, respectivamente, a tolerância ao herbicida glifosato e resistência a lagartas.  Metodologias que permitam o rastreamento de eventos transgênicos são globalmente mandatórias. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia baseada em PCR qualitativo e sequenciamento para detecção do gene CP4 EPSPS em Zea mays. Para tal linhagens comerciais de milho transgênico contendo o evento MON88017 e milho convencional foram submetidas ao procedimento de extração de DNA. Foram desenhados oligonucleotídeos para detecção parcial dos genes zeína e CP4 EPSPS. A reação de PCR para detecção das regiões parciais dos genes CP4 EPSPS e Zeína (como marcador endógeno da espécie Z. mays) foi então realizada. As três linhagens transgênicas de milho testaram positivo para os gene Zeína e CP4 EPSPS, bem como as duas linhagens convencionais testaram negativo para CP4 EPSPS e positivas somente para o gene zeína. A confirmação da presença das regiões gênicas, os produtos de PCR foram sequenciados e apresentaram 100% de identidade com sequência dos genes Zeína e CP4 EPSPS depositados no GenBank. Os resultados deste trabalho sugerem a aplicabilidade de um método “in house” para detecção qualitativa do gene CP4 EPSPS em cultivares de milho geneticamente modificado.