Diferenciação de células tronco mesenquimais do tecido adiposo de ratas sob efeito da lactação e da prolactina

Two different experiments were performed. Experiment 1 evaluated the effect of lactation on the osteogenic differentiation of rats adipose derived-mesenchymal stem cells (ADSCs). Experiment 2 evaluated the osteogenic differentiation of ADSCs under the effect of two concentrations of prolactin. In experiment 1, ten Wistar rats were divided into two groups: 1) control, and 2) lactating. At 30 days of lactation, both groups were euthanized and samples of visceral adipose tissue were collected for ADSC extraction. ADSC was grown in osteogenic medium for 7, 14 and 21 days. The tests of MTT conversion into formazan crystals, alkaline phosphatase activity, collagen synthesis, percentage of mineralized nodules and cells per field and quantification of genic transcript for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I by RT-PCR real time were made. The means were compared by the SNK test and the differences were considered significant if p <0.05. The lactating group had an increase in the conversion of MTT into formazan crystals at 7, 14 and 21 days. Alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in the lactating group were greater only at 14 days. The lactation group had a higher percentage of mineralization nodules than control group, and a decrease in the percentage of cells. Lactation promoted increased in osteopontin expression at all times, bone sialoprotein at 7 and 21 days and BPM-2 only at 21 days. However, lactation reduced the expression of osteocalcin in all periods. It is concluded that the cells of lactating rats presented a greater osteogenic potential characterized by an increase of the mineralized matrix synthesis. In the experiment 2, ADSCs were grown in a medium with and without the addition of prolactin and distributed into three groups: 1) CTM-TA (control), 2) CTM-TA with addition of 100ng/mL prolactin, and 3) CTM-TA with addition of 300ng/mL prolactin. At 21 days of differentiation, the tests of MTT conversion into formazan crystals, percentage of mineralized nodules and cells per field and quantification of genic transcript for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I by RT-PCR real time were made. The addition of prolactin reduced the conversion of MTT in group 3 and increased the percentage of cells/field in the groups 2 and 3, however without significantly increasing the percentage of nodules of mineralization and the expression of the genic transcription for for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I. It is concluded that the addition of prolactin in concentrations of 100ng/mL and 300ng/mL does not change the osteogenic differentiation to the CTM-TA of female rats despite of increasing the cellularity of the culture.

Foram realizados dois experimentos distintos. O experimento 1 avaliou o efeito da lactação sobre a diferenciação osteogênica das células tronco mesenquimais do tecido adiposo (CTM-TA) de ratas. O experimento 2 avaliou a diferenciação osteogênica das CTM-TA sob efeito de duas concentrações de prolactina. No experimento 1, foram utilizadas 10 ratas Wistar distribuídas em dois grupos: 1) controle e 2) lactante. Aos 30 dias de lactação, os animais de ambos os grupos foram eutanasiados para a coleta do tecido adiposo visceral e extração das CTM. As células foram cultivadas em meio osteogênico por 7, 14 e 21 dias. Foram realizados os testes de conversão do MTT em cristais de formazan, atividade de fosfatase alcalina, síntese de colágeno, porcentagem de nódulos de mineralização e de células por campoe a quantificação dos transcriptos gênicos para fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno tipo I por RT-PCR tempo real. As médias foram comparadas pelo teste SNK e as diferenças foram consideradas significativas se p<0,05. O grupo lactante apresentou maior conversão do MTT em cristais de formazan aos 7, 14 e 21 dias e atividade da fosfatase alcalina e síntese de colágeno aos 14 dias. O grupo lactante apresentou maior porcentagem de nódulos de mineralização em relação ao controle, porém com menor porcentagem de células. A lactação promoveu aumento da expressão de osteopontina em todos os tempos, de sialoproteína aos 7 e 21 dias e de BMP-2 aos 21 dias. No entanto, a lactação reduziu a expressão de osteocalcina em todos os períodos. Conclui-se que as CTM-TA de ratas lactantes apresentaram maior potencial osteogênico caracterizado por aumento da síntese de matriz mineralizada e da expressão de proteínas colagênicas e não colagênicas da matriz. No experimento 2, as CTM-TA foram cultivadas em meio osteogênico com e sem adição de prolactina e distribuídas em três grupos: 1) CTM-TA (controle), 2) CTM-TA com adição de 100ng/mL de prolactina e 3) CTM-TA com adição de 300ng/mL de prolactina. Aos 21 dias de diferenciação, foram realizados os testes de conversão do MTT em cristais de formazan, porcentagem de nódulos de mineralização e de células por campo e quantificação dos transcriptos gênicos para fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno tipo I por RT-PCR tempo real. A adição de prolactina reduziu a conversão do MTT no grupo 3 e aumentou a porcentagem de células/campo nos grupos 2 e 3, porém sem aumentar significativamente a porcentagem de nódulos de mineralização e a expressão dos transcritos gênicos para colágeno tipo I e para as proteínas não colagênicas. Conclui-se que a adição de prolactina nas concentrações de 100ng/mL e 300ng/mL não altera a diferenciação osteogênica das CTM-TA de ratas apesar de aumentar a celularidade da cultura.