Tissue damage in swine colonic explants exposed to Brachyspira hyodysenteriae strains with different levels of pathogenicity | Dano tecidual em explantes de cólon suíno expostos a cepas com diferentes níveis de patogenicidade de Brachyspira hyodysenteriae

A disenteria suína (DS) é uma grande preocupação para os suinocultores em todo o mundo. De forma a estudar medidas profiláticas eficazes, uma ferramenta de pesquisa robusta, mas pouco explorada pode ser empregada: a cultura de órgãos in vitro (IVOC). Não são muitas as instituições brasileiras que se utilizam técnica atualmente. Entre as razões para isso estão: o alto custo de implantação, equipamentos especializados e técnicas refinadas que exigem treinamento de pessoal. Assim, o presente estudo teve o objetivo de (1) adaptar um método de cultura de cólon IVOC já existente para ser acessível à maioria dos laboratórios brasileiros e (2) buscar características únicas de cepas patogênicas de Brachyspira hyodysenteriae que possam direcionar novos estudos na patogênese da DS. Um total de 480 explantes foram cultivados usando a técnica IVOC adaptada e divididos em 4 grupos experimentais: controle negativo (PBS), cepa de alta patogenicidade de B. hyodysenteriae (B_High), cepa de baixa patogenicidade de B. hyodysenteriae (B_Low) e controle positivo (LPS). 160 dos 480 explantes foram submetidos à análise de qPCR do gene TFF3, um marcador de inflamação intestinal aguda. Os 320 explantes restantes foram submetidos ao processamento histopatológico e análise morfológica de parâmetros como necrose de criptas e sobrevivência do explante. Os resultados da padronização da técnica mostraram que as adaptações feitas ao protocolo original causaram redução da sobrevida dos explantes, o que não prejudicou o uso da técnica. Verificou-se que o método adaptado de IVOC para explantes de cólon suíno é adequado para reprodução em laboratórios de pesquisa para fins de pesquisa semelhantes a este estudo, embora o uso de meios KGM e meios condicionados sejam recomendados se for necessária maior cobertura epitelial ou maior tempo em cultura. No ensaio acerca da DS foi observada uma expressão gênica aumentada de TFF3 em ambos os grupos infectados B_High e LPS (0,7 ±0,19 e 0,6 ±0,23 respectivamente) em comparação aos explantes dos grupos controle negativo e B_Low. Os grupos tratados com B_High e LPS também mostraram sobrevivência reduzida dos explantes (B_High: 0,47 ±0,13; LPS: 0,27 ±0,11) e abundância reduzida de células caliciformes (0,29 ±0,11 e 0,28 ±0,10 respectivamente) em comparação com os grupos PBS e B_Low. Reunindo nossos dados, foi possível sugerir que o aumento da expressão do gene TFF3 sinalizou a ativação do mecanismo de cicatrização e a liberação de mucinas. Esta ligação inovadora entre TFF e infecção por B. hyodysenteriae pode ser usada como base pare investigações adicionais da patogênese da DS.

Swine dysentery (SD) is a major concern for pig farmers worldwide. SD prevention relies solely on biosafety measures and prophylactic use of growth promoters, which contain low dosages of antibiotics. With the global awareness towards the conscious use of antimicrobials this practice is gradually being discouraged, and cases of SD started to re-emerge. In this sense, a robust but underexplored research tool might be employed: the in vitro organ culture (IVOC). Many recent studies were published in the last decades using this approach with impactful results, although Brazilian institutions have not disseminated this practice yet. Amongst the reasons for that are: the high cost of implementation, specialized equipment and refined techniques which require personnel training. Accordingly, the present study had the objective of (1) adapting an already existing IVOC colon culturing method to be accessible for most Brazilian laboratories, and to (2) seek for unique characteristics of pathogenic strains of Brachyspira hyodysenteriae which could direct further studies at the pathogenesis of SD. A total of 480 explants were cultured using the adapted IVOC technique and divided into 4 experimental groups: negative control (PBS), B. hyodysenteriae highly pathogenic strain (B_High), B. hyodysenteriae low pathogenic strain (B_Low) and positive control (LPS). 160 out of 480 explants were submitted for qPCR analysis of the TFF3 gene, a marker of acute intestinal inflammation. The remaining 320 explants were submitted for histopathological processing and morphological analysis of parameters such as crypt necrosis and explant survival. Technique standardization results have shown that the adaptations made to the original protocol caused reduced explants survival, which have not impaired the use of the technique. It was found that the adapted method of IVOC for swine colon explants is suited for reproduction in research laboratories for similar research purposes to this study, although the use of KGM media and conditioned media are recommended if higher epithelial cover or longer time in culture is required. At the SD trial was observed an increased gene expression of TFF3 at both B_High and LPS infected groups (0.7 ±0.19 and 0.6 ±0.23 respectively) in comparison to explants from the negative control and B_Low groups. B_High and LPS treated groups have also shown reduced explant survival (B_High: 0.47 ±0.13; LPS: 0.27 ±0.11) and reduced goblet cell abundance (0.29 ±0.11 and 0,28 ±0.10 respectively) compared with both PBS and B_Low groups. Assembling our data, it was possible to suggest that the increased TFF3 gene expression signaled the activation of the wound-healing mechanism and the release of mucins. This innovative link between TFF and B. hyodysenteriae infection can be used as lead in further investigation of SD pathogenesis.

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais