Validação de método e determinação de Ptaquilosídeo e Pterosina B por cromatografia líquida de alta eficiência em samambaias e no leite de vacas

The species Pteridium spp. is a poisonous plant known as bracken fern. The existing species in Brazil are: P. arachnoideum and P. caudatum. The fern has already been recorded in practically all Brazilian states. As for its occurrence, it is present in mountainous regions, from the south of Bahia to Rio Grande do Sul states, but is also invasive in areas of the states of Amazonas, Acre, Mato Grosso and Pernambuco. It is found in cold regions of high rainfall, acid soils, sandy and well drained. P. arachnoideum has two toxic principles: thiaminase, responsible for monogastric intoxication, and ptaquiloside (Pta), the carcinogenic substance responsible for intoxication in ruminants. Production animals consume the fern, especially its younger parts, even though it is not palatable. The effects of the ingestion are several, depending on the animal species and the dose ingested. Five different clinical syndromes are described in the literature: thiamine deficiency, progressive retinal degeneration, acute hemorrhagic syndrome (hemorrhagic diathesis), bovine enzootic hematuria (BEH) and upper digestive tract carcinomas. The currently available techniques for determination of Pta promote its conversion into pterosin B (PtB), but this has limited commercial availability. The aim of the present study was to develop a methodology for obtaining pterosin B (PtB) and for determining the amount of the ptaquiloside (Pta) carcinogen in plants and milk by high performance liquid chromatography (HPLC). Pta and PtB were measured in ferns Pteridium arachnoideum, collected in the states of Minas Gerais and Rio Grande do Sul, and in Dicranoptris flexuosa, Gleichenella pectinata and Sticherus lanuginosus collected in the state of Minas Gerais. In addition, samples of the ferns Pteris deflexa and Pteris plumula were sampled from Argentinian farms with BEH cases, but free of any Pteridium species. A total of 47 samples of mature leaves and 23 shoots samples were used. Blank milk samples were used for the development and evaluation of the analytical technique. For the application of the validated technique, 60 samples of raw tank milk from from several farms in Minas Gerais (MG) state, and 20 samples of raw milk from small properties from Ouro Branco city, MG, and 5 samples from Esmeraldas city, MG, both with cases of HEB and presence of P. arachnoideum in the rangeland. The concentration of Pta in leaf samples of P. arachnoideum ranged from 2.486±0.439 to 2.753±0.844 mg/g and PtB ranged from 0.684±0.152 to 0.885±0.197 mg/g, in P. arachnoideum sprouts Pta values ranged from 12.472±5.620 to 18.809±2.338 mg/g and PtB ranged from 4.026±0.982 to 10.424±0.233 mg/g. The values found in P. deflexa and P. plumula for Pta ranged from 2.424 to 3.235 mg/g and for PtB ranged from 0.727 to 1.543 mg/g. In addition, S. lanuginosus showed Pta levels of 2.466±0.173 mg/g and PtB levels of 1.572±0.166 mg/g, and D. flexuosa had Pta levels of 0.892-0.215 mg/g and PtB 0.466-0.083 mg/g. In G. pectinata, these toxic compounds were not detected until the present moment. Thus, S. lanuginosus and D. flexuosa were identified for the first time as producers of Pta and PtB, potentially toxic to ruminants. Regarding the methodologies used for the clean-up of the milk samples, two methods were efficient in cleaning the matrix and in the recovery of the standard after fortification tests. However, no milk samples were found positive for Pta and PtB.

A espécie Pteridium spp. é conhecida no Brasil como samambaia, samambaia do campo ou pluma. As espécies existentes são: P. arachnoideum e P. caudatum. A samambaia já foi registrada em praticamente todos os estados brasileiros. Quanto a sua ocorrência, está presente em regiões montanhosas, desde o sul da Bahia até o Rio Grande do Sul, porém também é invasora em áreas dos estados do Amazonas, Acre, Mato Grosso e Pernambuco. É encontrada em regiões frias de alta pluviosidade, solos ácidos, arenosos e bem drenados. P. arachnoideum tem dois princípios tóxicos: a tiaminase, responsável pela intoxicação em monogástricos, e o ptaquilosídeo (Pta), substância cancerígena, responsável pela intoxicação em ruminantes. Os animais de produção consomem a samambaia, especialmente as suas partes mais jovens, mesmo não sendo palatável. Os efeitos da ingestão são vários, dependendo da espécie animal e da dose ingerida. Cinco diferentes síndromes clínicas são descritas na literatura: deficiência de tiamina, degeneração progressiva da retina, síndrome hemorrágica aguda (diátese hemorrágica), hematúria enzoótica bovina (HEB) e carcinomas de vias digestivas superiores. As técnicas disponíveis atualmente para determinação do Pta promovem sua conversão em pterosina B (PtB), mas esta possui limitada disponibilidade comercial. O presente estudo teve por objetivos desenvolver uma metodologia para obtenção de PtB e determinar a quantidade do Pta, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em samambaias e no leite. Foram mensurados Pta e PtB em samambaias das espécies Pteridium arachnoideum, coletadas nos estados de Minas Gerais e Rio Grande do Sul, e Dicranoptris flexuosa, Gleichenella pectinata e Sticherus lanuginosus coletadas no Estado de Minas Gerais. Além disto, foram avaliadas amostras das samambaias Pteris deflexa e Pteris plumula, provenientes de propriedades da Argentina com casos de HEB, mas livres de qualquer espécie de Pteridium. Ao todo, foram utilizadas 47 amostras de folhas maduras e 23 amostras de broto. Foram utilizadas amostras de leite brancas para o desenvolvimento e avaliação da técnica analítica. Para a aplicação da técnica validada, foram utilizadas 60 amostras de leite cru de tanques provenientes de diversas propriedades do estado de Minas Gerais (MG), além de 20 amostras de leite cru de pequenas propriedades do município de Ouro Branco, MG, e 5 amostras do município de Esmeraldas, MG, ambas propriedades com histórico de casos de HEB e com presença da P. arachnoideum na pastagem. A concentração de Pta presente nas amostras de folhas maduras de P. arachnoideum variou de 2,4860,439 a 2,7530,844 mg/g e de PtB variou de 0,6840,152 a 0,8850,197 mg/g. Em brotos de P. arachnoideum obtivemos para Pta valores entre 12,4725,620 a 18,8092,338 mg/g e de PtB variou de 4,0260,982 a 10,4240,233 mg/g. Os valores encontrados nas espécies P. deflexa e P. plumula, para Pta variou de 2,424 a 3,235 mg/g e para PtB 0,727 a 1,543 mg/g. Além disso, S. lanuginosus apresentou níveis de Pta entre 2,4660,173 mg/g e de PtB 1,5720,166 mg/g e D. flexuosa apresentou níveis de Pta entre 0,8920,215 mg/g e de PtB 0,4660,083 mg/g. Em G. pectinata, não foi detectada a presença destes compostos tóxicos até o presente momento. Assim, S. lanuginosus e D. flexuosa foram identificadas pela primeira vez como produtoras de Pta e PtB, potencialmente tóxicas para ruminantes. Com relação às metodologias utilizadas para o clean-up das amostras de leite, foram encontradas duas metodologias eficientes na limpeza da matriz e também na recuperação do padrão nos testes de fortificação. No entanto, não foram detectadas amostras de leite positivas para Pta e PtB.