Análise filogenética molecular e biossistemática do complexo Habenaria repens Nutt. (Orchidaceae) no Brasil

Habenaria is one of the largest genera of Orchidaceae, but even though, it is not well studied. Few taxonomic studies and revisions have been done so far, and none of them comprise morphometric or population genetics approaches. One of the many species complexes in the genus is the one formed by H. repens and related morphotypes. Habenaria repens sensu lato occurs from south United States of America to north Argentina and, in Brazil, many morphological variants can be found. In order to clarify the relationships between Brazilian morphotypes and H. repens, as well as the relationships among them, and circumscribe these entities, three different techniques were used: molecular phylogenetic analyses, multivariate morphometric analyses and population genetics. Thirty one populations, encompassing two known species (H. repens e H. aranifera), six Brazilian morphotypes, and one population from the locality where the species type was collected, in the United States of America, were sampled. Two nuclear markers (ITS and ETS) and two plastidial ones (matK and trnK) totalizing 3,250 characters were used in the phylogenetic analyses. In these, the existence of three clades, not directly related and formed exclusively by entities that belong to the complex, was detected. Morphotype H. aff. repens6 belongs to one of these clades, whereas the other morphotypes are separated in two bigger clades. Seventeen floral and three vegetative characters were used in morphometric analyses with multivariate statistic techniques. Little morphological distinction was found between the morphotypes, and not all the groups formed match those obtained with phylogenetic and population genetics approaches. For this last method, five microsatellite loci were amplified for 295 individuals belonging to 20 populations. Five genetic groups were identified and these match partially some of the clades recovered in the phylogenetic analyses. The most consistent patterns found by all three markers were: the reunion of three populations previously classified as the typical form of H. repens (Curitiba-PR, Anguera-BA and Areias-PB), a group with morphotypes H. aff. repens3 and H. aff. repens4, and the discrimination of H. aranifera and of the populations that form H. aff. repens7. Considering all the evidences and the congruence between them, it is suggested that at least five species be recognized in Brazil. Despite the fact that H. aff. repens3 and H. aff. repens4 form a group recovered by all markers employed, they present a large variation in the size of all plant organs (characters, in a great part, not included in the analyses), and are easily distinguishable, which makes it questionable whether they represent a single taxon or not. Therefore, other analyses must be carried out in order to determine if they should be described as one or two new species. Habenaria aff. repens7, which belongs to the same clade as H. aff. repens3 and H. aff. repens4, is distinguishable by morphological and molecular markers and possesses diagnostic features that support its recognition as a different species. Morphotype H. aff. repens6 forms a clade isolated from the others and, although it does not differentiate itself in the morphometric analyses, it was not even included in the population genetic analyses, because it failed to amplify with the primers developed for H. repens. These evidences suggest it represents a distantly related species that resembles morphologically the species that form the rest of the complex due to convergence of floral traits. Thus, this entity must be recognized as a new species supported by characters of habit and size (not included in the morphometric analyses). In regard to the other clade obtained in the phylogenetic analyses, H. aranifera will be maintained as a species, once it was recovered as a consistent group in all the analysis. The remaining terminals, in spite of having a broad morphological variability and some of them have been separated by molecular markers, do not have diagnostic characteristics that sustain more than one species. Hence, they will all be accepted under H. repens, a species with broad geographic distribution, high level of polymorphism as well as all the other attributes of an ochlospecies, probably constituting a progenitor-derivative pair with H. aranifera.

Habenaria é um dos maiores gêneros de Orchidaceae, mesmo assim é muito pouco estudado. Poucas revisões e estudos taxonômicos foram feitos para o gênero e nenhuma abordagem morfométrica ou de genética de populações foi realizada até o momento. Um dos vários complexos existentes para o gênero é o formado por H. repens e morfotipos relacionados. Habenaria repens sensu lato tem distribuição do sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina e, no Brasil, diversos variantes morfológicos semelhantes a ela podem ser encontrados. A fim de esclarecer a relação dos morfotipos existentes no Brasil com H. repens e entre eles, e de circunscrever essas entidades, foi feito um estudo com três diferentes abordagens: análise filogenética molecular, análise morfométrica multivariada e genética de populações. Ao todo, 31 populações, englobando duas espécies reconhecidas (H. repens e H. aranifera), seis morfotipos do Brasil, e uma população proveniente da localidade onde o tipo de H. repens foi coletado, nos Estados Unidos da América, foram amostrados. Dois marcadores nucleares (ITS e ETS) e dois plastidiais (matK e trnK), totalizando 3.250 caracteres, foram utilizados em análises filogenéticas. Nestas análises, foi evidenciada a existência de três clados não diretamente relacionados formados exclusivamente por entidades pertencentes ao complexo. Em um deles, mais distantemente relacionado a todos os demais, situa-se apenas o morfotipo H. aff. repens6, enquanto os outros morfotipos se dividem em dois clados maiores. Dezessete caracteres florais e três vegetativos foram utilizados em análises morfométricas com técnicas de estatística multivariada. Pouca distinção morfológica foi obtida entre os morfotipos, e nem todos os agrupamentos de populações formados coincidem com aqueles obtidos pela análise filogenética e pela genética de populações. Para esta última, cinco loci microssatélites foram amplificados para 295 indivíduos de 20 populações. Cinco agrupamentos genéticos foram identificados e estes coincidem, em grande parte, com alguns clados recuperados nas análises filogenéticas. Os padrões mais consistentes encontrados pelo conjunto dos marcadores foram: a união de três populações da forma típica de H. repens (Curitiba-PR, Anguera-BA e Areias-PB), o agrupamento dos morfotipos H. aff. repens3 e H. aff. repens4, e a discriminação de H. aranifera e das populações do morfotipo H. aff. repens7. Considerando-se todas as evidências e a congruência entre elas, é sugerido que cinco espécies sejam aceitas para o complexo no Brasil. Apesar dos morfotipos H. aff. repens3 e H. aff. repens4 serem recuperados como um único grupo pelos três marcadores empregados, estes apresentam grande variação em função de tamanho de todos os órgãos da planta (em grande parte caracteres não empregados nas análises), sendo facilmente distinguíveis, o que torna questionável a manutenção destes como um único táxon. Assim, outras análises serão realizadas para determinar se estes serão descritos como uma ou duas novas espécies. O morfotipo H. aff. repens7, que pertence ao mesmo clado dos morfotipos H. aff. repens3 e H. aff. repens4 na análise filogenética, foi possível de ser distinto tanto nesta análise quanto pelos marcadores microssatélites e pela morfometria, possuindo características diagnósticas que o sustentam como espécie distinta. O morfotipo H. aff. repens6 forma um clado muito isolado dos demais nas análises filogenéticas e, apesar de não se diferenciar nas análises morfométricas, nem mesmo foi possível de ser incluído na análise de genética de populações, pois falhou na amplificação com os primers desenhados para H. repens. Essas evidências indicam tratar-se de uma espécie distantemente relacionada e que se assemelha morfologicamente por convergência de caracteres florais. Logo, essa entidade será reconhecida como uma nova espécie sustentada por características de hábito e porte (não incluídas nas análises morfométricas). Dentro do outro clado obtido pelas análises filogenéticas, H. aranifera será mantida com o status de espécie, uma vez que foi recuperada como um grupo consistente por todos os marcadores utilizados. Os demais terminais pertencentes a esse clado, apesar de possuírem ampla variabilidade morfológica e terem sido separados por marcadores moleculares, não possuem características diagnósticas que sustentem a sua separação. Por esse motivo, todos serão aceitos como H. repens, uma espécie de ampla distribuição geográfica, com alto grau de polimorfismo e possuindo todas as características de uma ocloespécie, provavelmente constituindo um par progenitor-derivativo com H. aranifera.