Detección de nuevas mutaciones en componentes de la vía de la proteina C asociadas con un mayor riesgo trombótico.

The protein C anticoagulant pathway plays a crucial role in the control of thrombus formation. Protein C circulates in plasma as an inactive zymogen that is converted to the active enzyme, activated protein C (APC) on the surface of endothelial cells by the thrombin-thrombomodulin complex. Another receptor, the endothelial protein C receptor (EPCR) binds protein C on the endothelial cell surface and further enhances the rate of protein C activation. APC is then released from the complex, binds protein S and inhibits thrombin formation by inactivating coagulation factors Va and VIIIa. The protein C pathway also plays a significant role in inflammatory processes, and displays anti-apoptotic and neuroprotective activities. Therefore, alterations in the expression or in the assembly of these four proteins could lead to a reduction in APC levels and to an increase in the thrombotic risk. We have developed a sensitive, rapid and reproducible assay for the determination of circulating APC levels. Using this assay, we have observed that reduced APC levels constitute an independent prevalent risk for venous thrombosis, which seems to be hereditary. We have identified several mutations in the proteins that form the protein C activation complex. The C1418T (Ala455Val) polymorphism in the thrombomodulin gene is associated with increased APC levels and decreased risk of venous thromboembolism. The A4600G (Ser219Gly) polymorphism in the EPCR gene determines the levels of soluble EPCR. And the G4678C polymorphism located in the 3´ untranslated region of EPCR is associated with increased levels of circulating APC and decreased risk of venous thrombosis, as we also observed in carriers of the factor V Leiden mutation, the most common genetic risk factor for familial venous thrombosis.

RESUMEN La hemostasia es el conjunto de procesos que controlan la fluidez de la sangre y la integridad del sistema vascular a través de cuatro grandes mecanismos, la coagulación y anticoagulación controlan la formación del coágulo, mientras que la fibrinolisis y la antifibrinolisis controlan la eliminación del coágulo. La coagulación sanguínea requiere mecanismos de regulación que eviten su propagación y extensión de un modo incontrolado. De hecho, la trombosis es la principal causa de mortalidad y morbilidad en países desarrollados. El sistema de la proteína C constituye uno de los principales mecanismos de anticoagulación, puesto que presenta actividades anticoagulantes, antiinflamatorias, antiapoptóticas, neuroprotectoras y profibrinolíticas. Para la activación de la proteína C se requiere el preciso ensamblaje de, al menos, cuatro proteínas sobre la superficie de la célula endotelial la trombina, la trombomodulina, la proteína C y el receptor endotelial de la proteína C (EPCR). La proteína C así activada (APC) se une a su cofactor la proteína S e inactiva a los cofactores V activado y VIII activado frenando, por tanto, la cascada de la coagulación. Por ello, como hipótesis planteamos que cualquier cambio que altere la expresión o el preciso ensamblaje de las proteínas que forman el complejo de activación de la proteína C, podría dar lugar a una reducción de la generación de APC. Además, dada la función anticoagulante del sistema de la proteína C, una reducción de la generación de APC daría lugar a un incremento del riesgo trombótico. Hemos desarrollado un ensayo para la cuantificación de los niveles circulantes de APC que es rápido, fácil de llevar a cabo y con un límite de detección lo suficientemente bajo como para detectar niveles muy reducidos de APC circulante posiblemente presentes en algunas patologías trombóticas. Mediante este ensayo hemos determinado que un nivel reducido de APC es un factor de riesgo prevalente e independiente de tromboembolismo venoso, el cual parece estar genéticamente determinado. 1 La determinación de la proteína C activada nos ha permitido seleccionar pacientes con tromboembolismo venoso y con niveles de proteína C activada persistentemente bajos. En estos pacientes, hemos llevado a cabo la búsqueda de nuevas mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del complejo de activación de la proteína C, identificando un número considerable de alteraciones en estos cuatro genes. Al secuenciar el gen de la trombomodulina identificamos el polimorfismo C1418T que produce un cambio de Alanina a Valina en el aminoácido 455. Este polimorfismo está asociado con niveles elevados de APC y con un menor riesgo trombótico. Al secuenciar el gen del EPCR identificamos diversas mutaciones. El polimorfismo A4600G que produce un cambio de Serina a Glicina en el aminoácido 219, determina los niveles plasmáticos de EPCR soluble. A su vez, identificamos el polimorfismo G4678C en la región 3´ no traducida del EPCR, el cual está asociado con niveles elevados de APC y con una disminución del riesgo trombótico, como hemos comprobado también ocurre en los individuos portadores de la mutación factor V Leiden, uno de los principales factores de riesgo trombótico. Al secuenciar el gen de la proteína C identificamos la mutación G1435A la cual produce un cambio de Glutámico a Lisina en el aminoácido 16, un residuo esencial para que la proteína C ejerza su función anticoagulante. Esta mutación es privativa de una familia en la que los individuos con historia de trombosis son portadores de la mutación. La presencia de esta mutación produce una deficiencia de proteína C tipo II. ____________________________________________________________________________________________________