Aplicaciones de la embriogénesis somática para la propagación y mejora de Quercus ilex L. y Pinus spp.

Esta tesis está enfocada a la aplicación de la embriogénesis somática para la conservación y mejora de Quercus ilex L., Pinus pinaster Aiton y Pinus pinea L., especies forestales representativas de los bosques de la Península Ibérica. La propagación clonal mediante embriogénesis somática (ES) es la herramienta más adecuada para la propagación de genotipos de élite y para la implementación de la llamada silvicultura multivarietal. Además los cultivos embriogénicos son explantos adecuados para iniciar experimentos de transformación genética con vistas a la introducción de características de interés o para estudios de genómica funcional. Quercus ilex (encina) es una de las especies más representativas del bosque mediterráneo, con alto valor económico por sus bellotas, que sirven de alimento a la ganadería porcina, y por la obtención de la llamada trufa negra o del Perigord. A pesar de su indudable valor ecológico y económico, la variabilidad en la producción de semillas y sus problemas de almacenamiento, junto con su recalcitrancia para ser propagada vegetativamente, impiden el abordaje de programas de mejora para la especie. Pinus pinea, es cultivada para la producción de piñones. La especie presenta problemas de propagación por métodos convencionales, por lo que se han desarrollado protocolos de propagación mediante organogénesis y embriogénesis somática. No obstante, hasta la fecha no se han descrito protocolos de transformación genética, a partir de líneas embriogénicas, que faciliten estudios de genómica funcional. Pinus pinaster es, en la actualidad, la conífera más empleada en las repoblaciones artificiales de la Península Ibérica. En el Estado Español, la elevada diversidad genética encontrada entre las distintas procedencias descritas, sugiere que la especie presenta un gran potencial de adaptación y por ello ha sido elegida como modelo para el estudio de la respuesta adaptativa de las coníferas al estrés hídrico. Para la propagación clonal de Pinus pinaster se han abordado ensayos previos de ES. No obstante e independientemente de las diferentes procedencias y familias utilizadas en estos estudios, la baja tasa de embriones maduros obtenidos sigue siendo el mayor hándicap para la aplicación de esta técnica a gran escala. Además de la selección de genotipos de élite, estos estudios han permitido la identificación de genes posibles candidatos a regular características relacionas con respuestas adaptativas a estrés hídrico y crecimiento. La validación de esos genes requiere de la disponibilidad de protocolos eficaces de transformación genética. Los objetivos de esta tesis se centraron en la elaboración de protocolos para la propagación de individuos adultos de Quercus ilex mediante embriogénesis somática. Se han estudiado los factores que promueven la inducción de embriogénesis somática en hojas, flores masculinas y flores femeninas, así como la proliferación y establecimiento de líneas embriogénicas obtenidas, su maduración y la posterior germinación de los embriones obtenidos. Se han realizado ensayos histológicos para el estudio del callo embriogénico y se ha determinado el nivel de ploidía del material embriogénico obtenido. Además, se han optimizado los protocolos para la maduración de callo embriogénico de Pinus pinaster y los protocolos para la transformación de Pinus pinaster y Pinus pinea mediante el cocultivo con Agrobacterium tumefaciens. A continuación se comentan los resultados más relevantes: Para la inducción de ES en hojas de encina, procedentes de varios genotipos, se han abordado 5 protocolos multifase utilizados en 3 especies diferentes de Quercus, en plantas de café y un protocolo no publicado con modificaciones en las citoquininas. En las condiciones ensayadas no ha sido posible inducir ES. En los ensayos de inducción de ES en flores femeninas, éstas se han cultivado, partidas por la mitad o aislando sus óvulos y se ha determinado el efecto de dos formulaciones de macronutrientes, MS (Murashige y Skoog) y B5 (Gamborg) y la presencia o ausencia de reguladores de crecimiento (10 μM de ANA y BA), sobre la inducción de embriogénesis somática. La presencia de reguladores en el medio de cultivo ha favorecido la formación de callo embriogénico, obteniéndose un único embrión somático a partir de óvulos aislados, en medio con reguladores de crecimiento, que no ha madurado ni proliferado. En el cultivo de flores masculinas, se han utilizado flores individuales o amentos enteros. Se han abordado protocolos multifase en los que se ha ensayado el efecto de los macronutrientes MS y SH (Schenk y Hildebrandt) y la concentración de reguladores de crecimiento (10 μM de BA y 10 ó 50 μM de ANA), así como el estadio de desarrollo del amento. Se han obtenido embriones somáticos y líneas embriogénicas en todos los ensayos realizados, a partir de 3 (VA, RE y HU) de los 5 genotipos ensayados. El genotipo, el estado de desarrollo del amento, y la composición del medio primario de inducción ejercieron una influencia significativa sobre este proceso, obteniéndose embriones únicamente en medio MS. De las líneas embriogénicas obtenidas del cultivo de amentos, se han realizado ensayos de maduración, combinando diferentes azúcares (sorbitol, inositol) y de germinación (con ABA y/o estratificación). Además, se ha ensayado el efecto de la aplicación de 6 μM de tiosulfato de plata (STS) y 4g/l de carbono activo (CA). El mejor tratamiento para amplificar y establecer líneas embriogénicas, mediante embriogénesis secundaria, se obtuvo con la combinación de 6% de sorbitol y 3% de sacarosa en medio MS. Por el momento no se ha conseguido la conversión de los embriones a planta completa. Parte del callo y de los embriones obtenidos, se han sometido a un estudio histológico para ver sus diferencias. El análisis histológico del callo ha mostrado que la presencia de 1 g/l de inositol para la maduración ha favorecido la embriogénesis secundaria; y en el análisis de los embriones cotiledonares se ha visto que, aunque estos estaban malformados, contenían los meristemos apical y radicular, así como el procámbium. Finalmente, se ha realizado un ensayo de citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de muestras de callo procedente de flores femeninas y de callo embriogénico y embriones procedentes de flores masculinas y se ha confirmado su carácter diploide. Se han abordado ensayos para optimizar la maduración de callo embriogénico de Pinus pinaster y se han comparado con un protocolo convencional. Como protocolo convencional, el tejido vegetal, disgregado en medio líquido se cultiva, sobre papel Whatman, durante 3 meses en medio de maduración, compuesto de medio de Litvay y con 60 g/l de sacarosa y 80 μM de ácido abscísico (ABA). Se ha estudiado el efecto del medio líquido, la desecación, la presencia de carbono activo (CA) y el periodo de cultivo con ABA. El cultivo en medio líquido ha provocado un sobrecrecimiento del callo que ha creado un estrés celular perjudicando este proceso. Así mismo, la desecación ha perjudicado la maduración del callo embriogénico. La reducción del período de incubación con ABA, de 3 meses a 1 mes, y la adición de CA han favorecido la obtención de embriones en los estadios precotiledonares, pero no ha sido determinante en la obtención de embriones en estadios cotiledonares. En un último experimento, se ha probado el efecto de 4 soportes diferentes para el cultivo del callo embriogénico: filtro de acetato de celulosa, filtro de nylon, filtro de poliéster y papel Whatman. El papel Whatman ha favorecido la maduración en la mayoría de las líneas. Los embriones obtenidos de estos experimentos, se han cultivado en medio de germinación (medio mLV sin reguladores y con 30 g/l de sacarosa), almacenándolos durante 3 semanas en frío (4ºC) y oscuridad. Posteriormente han colocado en ángulo de 40º a 25 ± 2ºC, manteniéndolos durante 14 días en oscuridad y finalmente las placas se han colocado bajo fotoperiodo de 16 horas. Las plántulas obtenidas se han transferido a alvéolos cubiertos con plástico transparente con un sustrato compuesto de turba y perlita, para su aclimatación y posterior paso a invernadero. Finalmente, se han desarrollado protocolos para la optimización de la transformación genética de Pinus pinaster y Pinus pinea utilizando la técnica del cocultivo de callo embriogénico con Agrobacterium tumefaciens. El éxito de la infección se midió mediante la expresión transitoria del gen gusA. En Pinus pinaster, se ha ensayado el efecto del tiempo de infección, la concentración bacteriana, el método de transformación (vacío vs. sonicación), la cepa bacteriana y los plásmidos sobre la expresión transitoria del gen gusA. La densidad óptica bacteriana de 0.7 y la aplicación de 10 minutos de infección, incluyendo 1 minuto de vacío, y la utilización de la cepa AGL1 con el plásmido pTAB16 se han mostrado como las más óptimas para la infección. Utilizando callo embriogénico de Pinus pinea, se ha ensayado el efecto de diferentes plásmidos y cepas bacterianas y de las concentraciones de bacteria, de tejido vegetal y de acetosiringona sobre la expresión transitoria del gen gusA. La DO600nm de 0.8, la concentración de 12 g de callo por cada 100 ml de medio de infección, la adición de 200 μM AS, y un período de infección de 5 minutos, incluyendo 1 minuto de vacío, y la utilización de la cepa AGL1 y del plásmido pTAB16 se han mostrado como los más adecuados para la transformación de callo embriogénico de Pinus pinea. Además, se ha determinado la concentración de agentes selectivos (PPT y kanamicina) que inhiben el crecimiento de tejido no transformado de P. pinaster y P. pinea, para una posterior selección de líneas transformadas. En P. pinaster, 2 mg/l de PPT y 5 mg/l de kanamicina, y en P. pinea, 1 mg/l de PPT y 5-10 de kanamicina, han sido suficientes para inhibir el crecimiento. Los protocolos descritos en esta memoria abren importantes posibilidades para la conservación y propagación en masa de genotipos selectos de Quercus ilex y Pinus pinaster, así como para la mejora genética de líneas seleccionadas de Pinus pinaster y Pinus pinea.