Función de los proteasomas en la degradación intracelular de proteínas en células de mamífero.

RESUMEN Las vías de degradación intracelular de proteínas, son numerosas y diferentes según la proteína, célula y situación metabólica. El proteasoma se considera una de las principales vías implicadas en estos procesos y esta Tesis Doctoral se ha centrado en averiguar algunos aspectos, todavía poco claros, en relación con esta vía proteolítica. Investigamos la posible existencia de poblaciones de proteasomas, en diversas localizaciones celulares que difieran en su composición en subunidades. Encontrando que tanto en hígado de rata como en células cultivadas de mamífero los proteasomas se localizan sobre todo en el citosol, pero también en el núcleo y asociados a la cara externa de la membrana del retículo endoplásmico. Además, las subunidades del proteasoma 20S y de sus complejos reguladores no se encuentran libres en las células en cantidades apreciables. Aunque los diferentes proteasomas se encuentran en todas esas localizaciones, la proporción de proteasomas 26S asociada al retículo endoplásmico es mayor que la de los proteasomas 20S y que los inmunoproteasomas y los proteasomas PA28 se encuentran en cantidades pequeñas en el núcleo. Determinamos en cultivos celulares, fibroblastos humanos, en diferentes condiciones de crecimiento, la contribución de los proteasomas y de otras vías proteolíticas a la degradación general de proteínas intracelulares. Encontrando que los inhibidores MG132 y ALLN, que han sido utilizados ampliamente como inhibidores específicos de los proteasomas, son también inhibidores muy eficaces de las vías proteolíticas lisosomales. Las principales vías proteolíticas en la degradación intracelular de proteínas de vida media corta y larga son los proteasomas y los lisosomas, que son responsables de un 80% o más de toda la degradación. Las distintas vías proteolíticas están reguladas de forma distinta ya que se activan o inhiben de manera diferente en las diferentes condiciones de crecimiento. Así por ejemplo, la macroautofagia se activa en ausencia de suero y/o de aminoácidos y su importancia disminuye en el ayuno prolongado, mientras que otras vías lisosomales diferentes a la macroautofagia se activan en células confluentes y su importancia aumenta en el ayuno prolongado. En cuanto a los proteasomas, son más activos en ausencia de suero probablemente debido a un incremento en la cantidad de proteínas ubicuitiladas y son menos activos en confluencia debido a la sustitución del complejo regulador 19S y de las subunidades intercambiables del proteasoma 20S por el complejo regulador PA28 y las subunidades del inmunoproteasoma, respectivamente. Analizamos el papel de los proteasomas en la degradación de una proteína específica de membrana plasmática, el receptor de LDL, y estudiamos si una de las mutaciones más frecuente en población española, la C358Y, que produce Hipercolesterolemia Familiar (HF), afecta a las vías degradativas de este receptor. Encontrando que la forma madura del receptor humano de LDL se degrada mayoritariamente por proteasomas, pero también por lisosomas y que la mutación C358Y del receptor humano de LDL retrasa su maduración provocando que parte de la forma precursora sea degradada por lisosomas y disminuye la estabilidad del receptor humano maduro de forma que su degradación transcurre a través de una vía casi exclusivamente lisosomal. Nuestros resultados suponen, por tanto, una cooperación de las dos principales vías degradativas en la degradación de una proteína específica. Además, una mutación puntual (C358Y) puede determinar que la vía de degradación del receptor cambie ya que en el caso del receptor mutante (C358Y) la vía degradativa pasa a ser mayoritariamente lisosomal. Es decir, los dos sistemas proteolíticos mayoritarios cooperan en la degradación de una misma proteína y su importancia relativa puede variar por mutaciones puntuales en la secuencia de la misma. __________________________________________________________________________________________________

The results demonstrate that different regulatory complexes and subpopulations of proteasomes have different distributions within mammalian cells. They were mainly found in the cytosol but were also present in the nucleus and associated with the endoplasmic reticulum. The 19S regulatory complexes were found to be relatively enriched in endoplasmic reticulum fractions from rat liver and the PA28 regulatory complexes were found to be localized predominantly in the cytoplasm. The contributions of the main proteolytic pathways to the degradation of long-lived and short-lived proteins in human fibroblasts grown under different conditions were also investigated. The effects of various commonly used pharmacological inhibitors of protein degradation were first analysed in detail. By choosing specific inhibitors of lysosomes and proteasomes, it was observed that both pathways accounted together for 80% or more of the degradation of cell proteins. With lysosomal inhibitors, it was found that serum withdrawal or amino-acid deprivation strongly stimulated macroautophagy but not other lysosomal pathways, whereas confluent conditions had no effect on macroautophagy and slightly activated other lysosomal pathways. With proteasomal inhibitors, it was found that, in exponentially growing cells in the absence of serum, activity of the ubiquitin-proteasome pathway increases, whereas under confluent conditions the contribution of proteasomes to degradation decreases, especially in cells deprived of amino acids. Interestingly, in confluent cells, the levels of two components of the 19 S regulatory complex and those of an interchangeable beta-subunit decreased. This was associated with a marked increase in the levels of components of PA28-immunoproteasomes. A mutation (C358Y) in the low-density lipoprotein receptor (LDLR), which is the most prevalent in a sample of familial hypercholesterolemia patients from Valencia (Spain) was finally investigated. Post-translational processing of the mutant LDLR precursor to the mature form was apparently retarded and part of this precursor was degraded by a lysosomal pathway. Also, the mature form of the mutant LDLR undergoes rapid degradation when compared to the wild type LDLR. The mature forms of wild-type LDLR and mutant C358Y are mainly degraded by proteasomes and lysosomes, respectively. Thus, a single mutation in the LDLR changes the degradative pathway of this protein.