Caracterización de genes rsf implicados en el control del ciclo celular en levadura

In S. cerevisiae, similarly with mammals cells, the major control point during cell cycle appears at late G1 phase, in a process called Start. In that moment cells decide to initiate or not a new round of cell division. In Start, when enviromental conditions are appropiate and cells reach a critical size, different processes begin such as DNA replication, bud emergence and spindle pole body duplication. One of the mechanisms contributing to cell cycle regulation is the control of transcription. In the budding yeast expression of some 250 genes is thougt to fluctuate throug the cell cycle. The transcription factors responsible for the periodic gene expression in late G1 phase are SBF (Swi4p-Swi6p) and MBF (Mbp1-Swi6p). To further understand Swi4p function, we step up a synthetic lethal screen for genes interacting with SWI4 (Igual et al. 1996). Fourteen conditional mutations which resulted in lethality only in the absence of SWI4 have been isolated. Two of these mutants, rsf12 and msn5swi4, were characterized in details in that work. In rsf12 mutant we were demonstrated a functional link between cyclin Clb5p, PKC pathway and SBF transcription factor in DNA metabolism and cell integrity. Moreover, we were characterized that ROT1 gen is functionally linked to the PKC pathway and is required for proper mitotic exit. In msn5swi4 mutant, we were identified that Msn5p is involved in control of Start, being required specifically for SBF activity but is not affecting MBF function. The karyopherin Msn5p is essential for the export of Swi6p to the cytoplasm during G2-M phases and this regulatory mechanism is acting in every cell cycle.

En S. cerevisiae, al igual que en células de mamífero, el principal control durante el ciclo celular está situado al final de la fase G1, en un punto llamado START (Cross 1995). En START se coordina el crecimiento con la división celular la célula solo entrará en un nuevo ciclo celular si ha alcanzado un tamaño crítico y las condiciones medioambientales son apropiadas. Un proceso clave en START es la activación de un programa de transcripción específico de la fase G1 tardía. Dos factores de transcripción similares, SBF y MBF, son los responsables de esta regulación de la expresión génica. Con el objeto de un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan START y la transición G1/S en el ciclo celular, se inició una estrategia de rastreo genético diseñada para identificar genes cuya mutación sea letal en combinación con una deleción en el gen SWI4 (Igual et al. 1996). De dicho rastreo se aislaron 14 mutantes rsf ("requiring SWI four"). La caracterización preliminar de estos mutantes puso de manifiesto que Swi4p interviene en muchas y variadas funciones además, e independientemente, de la regulación de las ciclinas CLN1,2 (Igual et al. 1997). Durante el presente trabajo se han caracterizado dos de estos mutantes rsf. En el caso del mutante clb5swi4, se ha demostrado la conexión funcional de la ciclina Clb5p, de la ruta PKC y del factor de transcripción SBF en procesos de metabolismo del DNA y en el mantenimiento de la integridad celular. También se ha demostrado que la inactivación del gen CLB5 provoca defectos en la integridad celular siendo un mutante clb5 sensible al tratamiento con SDS, CFW, latrunculina B, cafeína o a la digestión con enzimas que degradan la pared celular como la zimoliasa. Estos resultados indican que la ciclina Clb5p está implicada en el metabolismo de la pared celular y en el mantenimiento de la integridad celular. Por otro lado, se ha descrito que el gen ROT1, al cual se le había relacionado con la ruta PKC por estudios de interacciones genéticas, participa en la salida de mitosis y en citoquinesis. Se ha demostrado que Rot1p presenta funciones antagónicas a la ciclina Clb2p en el control de la salida de mitosis y participa en la regulación del citoesqueleto de actina. En el segundo caso, la caracterización del mutante msn5swi4 realizada durante los últimos años ha permitido identificar una relación funcional entre el factor de transcripción de ciclo celular SBF y la carioferina Msn5p. También se ha demostrado que Msn5p participa en el control de Start regulando la transcripción dependiente de SBF y no la de MBF. Msn5p es una carioferina que se requiere para la exportación de Swi6p al citoplasma en la transición G2/M del ciclo celular. Este mecanismo de exportación de Swi6p al citosol es esencial para su funcionalidad y es un proceso de regulación que actúa en cada ciclo celular. Nuestros resultados son un buen ejemplo de la importancia de la regulación espacial en el control del ciclo celular. En el caso de Swi6p el concepto de regulación espacial va más allá en el sentido de que un interruptor funcional de la proteína se acopla a cambios en la localización subcelular. En el curso del trabajo se observaron algunas diferencias funcionales entre las ciclinas Cln1p y Cln2p. Estas ciclinas son proteínas muy similares, su niveles se regulan por los mismos mecanismos moleculares y la actividad quinasa asociada fluctúa con la misma periodicidad. Además, numerosos estudios han puesto de manifiesto el solapamiento funcional entre estas dos ciclinas lo cual ha conducido a considerarlas como proteínas equivalentes. Sin embargo, diversas observaciones nos han permitido esclarecer el diferente papel que para la célula de levadura juegan Cln1p y Cln2p en la progresión en la transición G1/S del ciclo celular, concretamente en el proceso de gemación.