Perfil de miRNAs secretados en el fluido endometrial a lo largo del ciclo menstrual. Caracterización funcional. Potencial uso como herramienta diagnóstica de receptividad endometrial no invasiva.

INTRODUCCION La implantación embrionaria y el embarazo requieren una comunicación entre el endometrio y el embrión pre-implantatorio. El endometrio humano posee dos funciones principales: la adquisición temporal de un fenotipo adhesivo que favorezca la implantación embrionaria, también denominada “receptividad endometrial”, y una vez se produce implantación, ejerce un segundo papel en la invasión, placentación, desarrollo fetal y finalmente el parto. Para ello, el endometrio dialoga de forma activa con el embrión mediante mecanismos de señalización que pueden ser secretados de forma paracrina hacia el fluido endometrial que nutren y regulan el correcto desarrollo embrionario. Actualmente, no existe consenso en los marcadores diagnósticos para determinar el estadio de receptividad endometrial a nivel clínico, únicamente los criterios de “Noyes” surgidos en 1975 han sido ampliamente empleados. Sin embargo, dado que consisten en criterios histológicos, ha sido ampliamente discutida la elevada variabilidad inter-observador. Desde entonces, se han hecho grandes esfuerzos en la búsqueda de alternativas moleculares cuantitativas, como por ejemplo los estudios transcriptómicos, proteómicos, lipidómicos y metabolómicos, e incluso se ha conseguido desarrollar una herramienta predictora que está siendo actualmente usada a nivel clínico, denominada “array de receptividad endometrial”, basada en los perfiles transcriptómicos analizados a partir de biopsias tomadas del endometrio en día 19-21 de ciclo menstrual natural, coincidente con el estadio de receptividad endometrial. Otra de las limitaciones se debe al uso de biopsias endometriales, consideradas un método disruptivo que implica realizar transferencia embrionaria en un ciclo posterior. En los últimos años, un nuevo concepto denominado “secretómica”, basada en el estudio de las moléculas presentes en las secreciones, ha introducido nuevas posibilidades en el ámbito del estudio endometrial. Diferentes tipos de moléculas tales como proteínas, lípidos y metabolitos han sido hallados en secreciones obtenidas de la cavidad endometrial. Además, no se han observado defectos en las tasas de implantación tras aspiración de pequeñas muestras de secreciones previa a la transferencia embrionaria en el mismo ciclo. Por otro lado, hace dos décadas se descubrieron un nuevo tipo de ácido nucleico, los miRNAs. Dichas moléculas poseen alrededor de 19-22 nucleótidos y funcionan como reguladores negativos de la expresión génica, para ello bloquean la traducción de RNA mensajeros mediante la hibridación por complementariedad de secuencia y secuestro por el complejo RISC. Se han descrito miles de miRNAs en el genoma humano, cada uno capaz de reconocer cientos de genes diana, lo que supone una gran variedad funcional dependiendo del contexto biológico. Además, estas moléculas han demostrado ser capaces de acomplejarse con lípidos/proteínas, ser secretadas en exosomas u otro tipo de vesícula y sobrevivir largos periodos de tiempo sin degradarse. Por estos motivos, se han propuesto como un potencial biomarcador en diferentes patologías humanas. Diferentes trabajos han recogido la expresión de miRNAs en el tejido endometrial durante la fase de receptividad, pero ninguno de ellos ha explorado las secreciones endometriales a lo largo del ciclo menstrual, ni su función más allá de la predicción bioinformática. Recientemente se ha demostrado la capacidad de diversos tipos celulares de internalizar miRNAs a través de diferentes mecanismos que aún no han sido completamente descritos, como endocitosis y/o receptores específicos de membrana. La hipótesis de la presente tesis afirma que los miRNAs están presentes en las secreciones endometriales, que se expresan con un patrón determinado a lo largo del ciclo menstrual, y que poseen la capacidad de alcanzar al embrión-preimplantatorio y regular la implantación embrionaria a un nivel no descrito hasta ahora. OBJETIVOS • Objetivos generales: Determinar la presencia y patrones de miRNAs en las secreciones endometriales humanas a lo largo del ciclo menstrual, enfocándonos en la ventana de implantación para hallar potenciales biomarcadores de receptividad endometrial. Determinar si las secreciones endometriales, así como el cultivo in vitro de células epiteliales endometriales primarias están secretando activamente exosomas con presencia de miRNAs. Determinar la capacidad embrionaria para incorporar miRNAs vehiculazados o libres. Determinar la regulación génica y efectos fenotípicos de los miRNAs incorporados por el embrión. • Objetivos específicos: Estudiar los efectos transcriptómicos y proteómicos de hsa-miR-30d en las células epiteliales endometrial. Determinar cambios en los patrones de metilación derivados de altos niveles de hsa-miR-30d en las células epiteliales endometriales. Demostrar la producción de exosomas in vitro en el medio de cultivo de células epiteliales endometriales primarias. Demostrar la presencia de miRNAs en formas libres o vehiculizadas METODOLOGÍA Tomamos muestras de secreciones endometriales a lo largo del ciclo menstrual dividido en 5 grupos (fase proliferativa temprana, proliferativa tardía, fase secretora temprana, secretora media (o ventana de implantación) y secretora tardía), realizamos extracción de RNA total, microarrays de miRNAs, PCR cuantitativa, analisis bioinformático, aislamiento de exosomas, microscopía electrónica, co-cultivo de embriones murinos junto con exosomas o miRNAs, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido. Por otro lado, tomamos muestras de biopsias endometriales y realizamos aislamiento y cultivo primario de células epiteliales endometriales, transfecciones transitorias con hsa-miR-30d, extracción de RNA total, de proteína total y de DNA total. Análisis transcriptómico mediante microarrrays de expresión génica, análisis proteómico mediante iTRAQ, analisis epigenético mediante MeDIP, PCR cuantitativa, western-blot e inmunohistoquímica, aislamiento de exosomas producidos por el cultivo in vitro y análisis bioinformático. RESULTADOS Mediante microarrays hallamos 19 miRNAs diferencialmente expresados en las secreciones endometriales a lo largo del ciclo menstrual con respecto a la ventana de implantación, momento durante el cual entran en contacto con el embrión pre-implantatorio. En concreto, hallamos altamente up-regulado hsa-miR-30d, que correlaciona con estudios previos sobre tejido endometrial. Además, exploramos los efectos transcriptómicos (176 genes diferenciales), proteómicos (108 proteinas diferenciales) y epigenéticos de la transfección de hsa-miR-30d en las células epiteliales endometriales “in vitro”. De forma relevante hallamos infra expresado el gen asociado a impronta H19, lo que puede deberse a una sobre-expresión de la proteína para el gen DNMT1, que está implicado en metilación del DNA, que resultó confirmado al hallar hipermetilada la región promotora para el gen H19. Por otro lado, el conjunto de miRNAs endometriales son secretados de forma libre o asociados a vesículas tipo exosomas e incorporados por las células del trofectodermo embrionario, induciendo modificaciones transcripcionales y funcionales asociadas con el fenotipo adhesivo “in vitro” del embrión murino en el caso de hsa-mir-30d. CONCLUSIONES 1. Los miRNAs están presentes en las secreciones endometriales a lo largo del ciclo menstrual. 2. El perfil de miRNAs durante la ventana de implantación muestra importantes diferencias en comparación al resto de fases del ciclo menstrual, lo que apoyaría su uso como nuevo biomarcardor de receptividad endometrial. 3. La expresión ectópica de hsa-miR-30d en células epiteliales endometriales humanas induce modificaciones transcriptómicas relacionadas con ciclo celular, proliferación y desórdenes endocrinos que podrían influenciar la receptividad endometrial. 4. El receptor de estrógenos es un regulador de los efectos asociados con hsa-miR-30d. 5. La expresión ectópica de hsa-miR-30d en las células epiteliales endometriales primarias humanas induce modificaciones proteómicas relevantes para la fisiología endometrial y el estatus epigenético. 6. Existe un incremento en el estatus de la metilación de la región diferencialmente metilada del gen H19 en las células epiteliales endometriales primarias tras el tratamiento con hsa-miR-30d 7. Las células epiteliales endometriales secretan exosomas tanto en el fluido endometrial como en los medios de cultivo “in vitro”. 8. Los exosomas y los miRNAs libres pueden ser internalizados por el trofectodermo de los blastocistos murinos eclosionados. 9. Hsa-miR-30d está presente en las secreciones durante el periodo de receptividad endometrial y puede modular la expresión génica y el fenotipo de adhesividad “in vitro” de los embriones murinos eclosionados y listos para implantar.

Abstract Embryonic implantation and pregnancy require communication between the maternal endometrium and the preimplantation embryo. During this process, the blastocyst actively regulates the endometrium, whereas the endometrial fluid, secreted by the endometrial epithelium, nurtures and regulates the development of the embryo. In the present dissertation, we show that maternal miRNAs secreted by the endometrial epithelium into the endometrial fluid act as transcriptomic regulators of the preimplantation embryo. Assessment by microarrays revealed the presence of specific maternal miRNAs in the endometrial fluid that are associated with the window of implantation and are in direct contact with the preimplantation embryo; specifically, we explored endogenous effects of hsa-miR-30d, the most prominent miRNA during endometrial receptivity in the epithelial endometrial cells. These endometrial miRNAs are secreted either freely or as exosome-associated molecules and are then taken up into the embryo via the trophectoderm, where they induce embryonic transcriptional and functional modifications. Our results offer the possibility for development of a novel non-invasive tool to predict the receptivity status of endometrium based on miRNAs profiles secreted in endometrial fluid. Furthermore, we demonstrates a model in which endometrial maternal miRNAs function as transcriptomic regulators during early embryo development, thus offering a new perspective on the cross-talk during implantation and pregnancy, and potentially on the developmental origins of certain adult diseases.